《PCR引物或者产物的磷酸化反应和平端连接的经验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR引物或者产物的磷酸化反应和平端连接的经验（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、交流】平末端连接构建载体的一些个人经验-2006/08/2021:33、载体和插入片段的量都要比黏末端连接时的用量多，可以增加到倍以上。2载体务必去磷酸化处理许多公司都有这类酶，比如的点击进入产品页面。3如果是生成插入片段，要用产生平端片段的酶如，必须磷酸化末端，可以磷酸化引物，也可以磷酸化产物，我一般磷酸化产物，这一步最关键也最容易遗漏请参考点击进入产品介绍。普通酶以后可以补平再做连接，但是仍然需要磷酸化，当然如果是以后再酶切成平端那和普通酶切片段是一样的。4、按照分子克隆第三版介绍，如果线性化载体时所用的内切酶在插入片段序列内没有位点，酶切和连接可以在一个反应体系内同时完成相关内容请查阅分
2、子克隆，但是我的实验证明这个方法效率并不高。我建议采用下面方法：酶切载体分离片段插入片段磷酸化纯化片段按照正常连接反应，体系内加入线性化载体所用内切酶，按照酶切1/1浓0度加入。这样基本上可以完全阻断载体自连接击因为凡是载体自连都将被酶切再次线性化，而插入片段形成新质粒则不会被酶切但，提高连接效率。5连接酶用量也要适当增加，建议用高浓度连接酶点击连接产品页面，不要用快速连接方法。6连接体系是否加入，好象没有显著差别，另外分子量也没有特殊要求，到都曾经出现在公司药合里面。引物或者产物的磷酸化反应：stone似乎不太高兴了。连接效率我还真是不太懂，而且离开具体的实验条件谈连接效率我觉得也没有多大意
3、义，因为最终的转化子数和期望重组子比例受太多因素影响（质粒自连反应的影响因素较少，倒是可以以此为实验模型讨论）而不仅仅是连接温度和时间。不过还望stone网友给出有出处的定义。对于连接反应，实验条件早有定论。一般都是采用公司产品目录上的推荐条件，37C时T4DNA连接酶的活性一般最高但因为粘端的互补氢键结合容易因分子热运动脱开。所以折衷为16C反应，还有人建议用PCR仪作连接，低温粘端退火，然后高温连接（没有实验数据，但还讲得出道理）。平端连接的推荐温度是22C，分子克隆为20C，酶量要加大100倍，反应液中加入PEG和六氯高钻合氨等可以刺激连接。至于反应时间，一般是16小时，不过也有公司产品
4、目录上说23小时。因此，我的体会是如果做常规克隆，如Phdlifei网友所言，只要其他的操作没问题的话，连接条件可以比较随意。我一般就是粘端室温2-3h，平端22C16小时。如果结果不好的话，应该是其他操作造成的。TA克隆更偏向于粘端连接,生工的产品目录上的反应条件就是16C2小时到过夜。我觉得stone网友的反应条件可能并不是万试万灵的良方，所以作为版主我有一定的义务质疑，以体现本版具有一定的水平和基本的科学态度也欢迎大家参与讨论。至于stone网友倒是没有谁会一定要您回答，所以没必要作出很忙的姿态,BBS讨论和公安传讯一样，大家都有沉默权.我倒是怕你的方法会误导别人，浪费试剂和宝贵的时间。?
