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1、通过深焦磷酸测序揭示不同连作跨度香草土壤对微生物群落成员和结构的显著影响 摘要：在本研究中，通过16S核糖体深焦磷酸测序RNA（rRNA）基因内转录间隔区（ITS）对香草连作时间域的土壤细菌和真菌群落进行了评估。结果表明，香草的长期连作显著改变土壤微生物群落。土壤真菌多样性指数随连作年数增加，而土壤细菌多样性的比较稳定。布雷柯蒂斯相异聚类和UniFrac加权主坐标分析（PCoA）显示连作时间是真菌群落结构的主要决定因素，但不适合细菌群落结构。随着香草单作的年份增加，厚壁菌门，放线菌，拟杆菌门、担子菌门的相对丰度（RAS）被耗尽。在门的水平皮尔森相关表明放线菌，装甲菌门，拟杆菌门，疣微菌门，厚壁
2、菌门与香草病情指数（DI）有显著负相关，而对真菌无显著相关性。此外，尖孢镰刀菌的数量积累随着年份增加，香草数据项显著正相关。相反的是，有益细菌包括慢生根瘤菌和芽孢杆菌的数量显著降低。总之，长期连作使土壤变弱和香草干枯萎病后，并可归因于变化土壤微生物群落的成员和结构，即，有益微生物的减少和病原真菌的积累。关键词土壤细菌和真菌群落。连作。香草。枯萎病。焦磷酸测序前言 连作是生产实践中年复一年的在同一块地种植相同的土壤作物，可能诱发不同作物的特定微生物群落。在一年生作物中通常导致产量下降、植物土传病菌富集。多年生植物通常生长缓慢和不稳定，再植时会遭遇连作障碍。 香草是多年生草本藤蔓植物，具有很高的经
3、济价值，在热带和亚热带地区已广泛种植。然而，由于长期单一种植，已有香草种植国报道各类品种产生了土传病原真菌。在香草种植区发生了许多毁灭性的、分布广泛的疾病，特别是由尖孢镰刀菌引起的香草茎和根腐病等。在中国，这种病使最长期单一种植香草的田野受到了灾害，造成巨大的经济损失。对于维护土壤健康，土壤微生物是非常重要的。许多研究表明，土壤微生物群落受各种因素的影响，包括植物，土壤类型，有机添加物，农业管理等。 最近，越来越多的研究推测连作导致土壤微生物群落的成员和结构中断。此外，在连作农业机制下真菌病原菌容易积累。然而，连作对土壤微生物群落以及土壤病的具体影响仍不清楚。特别是在热带地区，在不同热带作物包
4、括香草的土壤微生物群落的变化很少有研究并被记录，据我们所知，赵某等人报道，香草根际土壤可培养细菌数量随香草连作时间下降，而真菌数量随着时间的推移而增加。6S核糖体RNA（rRNA）和18SrRNA基因文库建设和变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法在过去主要用于连作体系下的土壤微生物群落研究；然而，只有一定的优势微生物菌群才可以使用这些方法检测到。的发展，如454焦磷酸测序在短时间内提供了一个低价格，高精度，高通量的研究土壤微生物多样性和群落结构的方法。最近，下一代测序技术已广泛应用于农业中对土壤微生物细菌和真菌群落的研究。许多研究所使用的下一代测序技术都集中在连作系统中土壤真菌或土壤细菌群落有针对
5、性的单一实验。在这项研究中，通过FLX + 454测序技术利用V4-V5高变区域分别对不同年长的香草种植土壤细菌和真菌群落的16S rRNA基因内转录间隔（its5-its4）作为细菌和真菌的条码标记。本研究的目标是（1）比较取自四组具有完全不同生产能力，不同时间跨度的香草土壤细菌和真菌群落的组成和结构，（2）探索与香草枯萎病相关的潜在的微生物群落。材料和方法实验地点描述和取样实验地点位于海南省兴隆市中国科学院热带农业科学院热带饮料和热带香料研究所，（11020E，1873n），具有热带季风气候。平均温度和降水量分别为24.5C和2201毫米。不同时间跨度的香草品种农艺管理，施肥制度相似。土壤
6、样品采自连续1，6，11，21年种植香草的田，并分别标记为“a,” “b,” “c,”和 “d,”。除去香草植物和表面覆盖物后每个时间域分别随机采集45个点（020厘米深和直径2.5厘米），15个点的样品随机混合（每个时间域三重复），全部的12个土壤样品放进无菌塑料袋保存在实验室冰箱里。通过2毫米筛彻底筛选均匀后，每个样品的一部分风干作为化学分析，其他部分的存储在70C用于以后的DNA提取。土壤理化性质的测定土壤水悬浮液（1:5w/v）摇匀后30分钟分别采用玻璃电极pH计和电导率仪测定土壤的pH值和电导率（EC），分别采用重铬酸钾外加热法和碱解扩散法测定有机物（OM）和有效氮（水解性氮）。有效
7、磷从碳酸氢钠钠离子提取，采用钼蓝方法确定。采用火焰光度法确定从醋酸铵中提取有效k的含量。使用醋酸提取并用原子吸收分光光度计测定钙镁在土壤中的可交换性。采用盆栽试验综合评价土传疾病基于目测观察香草的四个时间域，我们发现随着连作的年份增加阻碍了香草的生长。然而，不能得到每块地准确的枯萎病的病情指数，因为香草是土地出现病株后再植的。从香草四个时间域通过盆栽试验对各自的田间土壤疾病进行评估，并确认结果。有5节（655厘米）的香草茎被选定为扦插苗，吴雄等三人的扦插苗种植在一盆（12公斤土）。每个时间序列进行三次重复，每次重复含三个盆里的九株香草扦插苗。所有的花盆随机放置在海南省兴隆市热带农业科学院里的温
8、室，2013年从四月到六月平均温度30C和平均湿度72%。在2个月里，没有使用化肥，每34天进行灌溉保持土壤水分含量。疾病指数根据DI = （患病植株数疾病严重程度指数）/（总的调查植株数最高疾病严重程度指数）100%计算。疾病严重程度指数（DSI；05）是参考根据徐等人的方法并做出一些修改，其中0 =没有任何明显的症状的健康香草茎，1 = 1至25%的茎变色，2 = 26到50% 茎变色，3 = 51到75%茎变色，4=76 to 99 % 茎变色， 5=植株完全死亡。DNA提取和PCR扩增使用DNA提取试剂盒（Mobio实验室，卡尔斯巴德，美国）按照使用说明提取每块地的微生物总DNA。DN
9、A的浓度和质量（A260/A280的比值）采用分光光度计测定。从土壤中提取的DNA作为16S rRNA基因的模板和ITS的扩增区域。细菌引物为515f（5- gtgccaGCMGCCGCGG-3) 和 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3)用于扩增400 bp片段，生成V4到V5细菌16SrRNA基因的高变区。真菌特异性引物ITS5- （5ggaagtaaaagtcgtaacaagg - 3）和ITS4（5- tcctccgcttattgatatgc-3）用于扩增600 bp真菌内部可转录间隔区的片段。PCR扩增是一个25L of10 2.5L的反应：10个2.5 l
10、反应缓冲液，每个引物10m， 2.5 mM dNTPs，40ng的模板，0.625单位的Takara探针。扩增步骤如下：16SV4-V5 rRNA基因在94C变性4分钟，随后25次变性（94 30 S），退火（55C，45S），延伸（72，1min），最后的延伸在72C下7分钟；内转录间隔区基因在变性开始4分钟时保持94，然后进行35次变性（94 30 S），退火（50 45 S），延伸（72C 1 min），和最后的扩展在72下进行7 min。同时进行三个样品的扩增，然后把产物汇总。然后使用PCR试剂盒将所有样品的产物纯化。每个样品的扩增产物合并在一支管中，PCR乳液用作454焦磷酸测序所要
11、求的单链上的念珠。在454 GS-FLX+上测序仪进行焦磷酸测序。焦磷酸测序数据处理按照Schloss SOP使用 Mothur v. 1.25.1进行细菌序列分析。均聚物中长度等于或大于8 bp小于200 bp模棱两可的序列可从数据集中去除，然后基于特异的7-bp片段过滤片段分配到土壤样品中。去除引物序列和片段后，特异序列使用Silva 106数据库进行对比。通过筛选，过滤，预聚类分析，和嵌合体的去除等过程，用其余序列构建一个0.2阈值的距离矩阵。用平均相邻算法（97%相似截断）将这些序列聚类为操作分类单元。从每个OTU具有代表性的序列中使用Bayesian（60%置信度）方法进行分类。 真
12、菌序列使用 Mothur v. 1.25.1进行第一步质量控制，允许不超过两个错配的正向引物序列，码序列不超过一个错配，均聚物不超过八个核苷酸。其余的序列基于条码被分配到每个土壤样品。使用ITS Extractor v. 1.1从真菌ITS数据集中提取全长的ITS1分区，因为碎片的存在可能会使聚类和相似搜索出现误差。过滤后使用CAP3对ITS1区域片段进行下一步的校准。使用最小重叠的100bp将OTU分配在97 % 鉴别水平。最终，使用UNITE和INSD数据库确定OTU代表序列。OTU具有97%的序列相似性时，使用UNITE 和INSD 数据库无法确定的 用NCBI数据库进行BLAST搜索。
13、值得注意的是，单个（OTU在全部12个样本中，只包含一个序列）下游分析被拆除了。统计分析对于所有的参数，单因素方差分析使用Turkeys HSD进行多重范围测试比较。微生物分类群丰度，土壤性质及所有的门与香草干腐病DI的皮尔逊相关系数使用SPSS计算。所有分析的多样性使用3%临界值差异度进行OTU聚类。结果随着香草连作年份增加，土壤有机物质，有效磷，可交换性钙含量，PH值显著增加，而土壤电导率（EC）和可交换性镁含量显著降低。香草盆栽实验中，茎腐病病情指数随着连作年份显著增加。连作21年的土壤几乎没有生长香草。在所有样品中占主导地位的细菌门为变形菌门（35.98%），酸杆菌门（26.28%），
14、拟杆菌门（6.99%），厚壁菌门（3.06%），（2.04%），土壤放线菌（1.45%），与硝化螺旋菌（1.43%）（相对丰度（RA）1%）占主导地位的真菌为串珠状赤霉（17.06%），马勃(8.41 %)，Ceratocysti sparadoxa(4.96 %)，尖孢镰刀菌（3.93%），头孢叉状亚属（1.30%），细菌和真菌多样对于细菌来说，四块地的土壤样品微生物种群没有显著差异，对于真菌来说，在连作六年以后的土壤里显著增加。（表1）土壤细菌多样性的比较稳定，土壤真菌多样性指数随连作年数增加（图2）基于 Bray-Curtis距离聚类分析显示采集自同一时间段的土壤样品细菌和真菌群落更相似。连作6年，连作11，连作21年土壤细菌和真菌群落聚在一起，并与连作1年土壤分开。连作一年土壤与连作21年土壤细菌真菌群落差异最大。（图3）
