有机酸论文

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1、黑曲霉利用糖质原料发酵生产柠檬酸的研究进展 摘要：本文介绍了近几年国内外黑曲霉利用糖质原料发酵柠檬酸的新工艺，以及这些探索 实验的结果。旨在探究一些有利于黑曲霉发酵柠檬酸产量的提高以及生产成本的降低的理 论依据以及实验依据，提出黑曲霉发酵生产柠檬酸工业化生产的发展前景。 关键字：黑曲霉 发酵 柠檬酸 新进展Study of the research developments of Aspergillus niger using sugar products to produce citric acidSunjiatong1(1,College of Biotechnology，Tianjin

2、University of ScienceTechnology，Tianjin 300457，China)Abstract: It gives us a brief insight into the latest technologies of Aspergillus niger using sugar products to produce citric acid and the corresponding experimental results, aiming at exploring the basis for high-production Aspergillus niger and

3、 better ways to reduce costs. Also it intends to display new outlook of this area.Keywords：Aspergillus niger；fermentation；citric acid；new developments 前言：柠檬酸又名枸橼酸，是利用微生物代谢生产的一种极为重要的有机酸，也是世界上以 生物化学方法生产的产量最大的有机酸。柠檬酸的用途广泛，在食品，化工，建筑、印染、 皮革、洗涤等行业都有应用。近年来，随着工业的发展，国民经济也持续的发展，加之柠檬 酸用途的不断扩展，人们对含柠檬酸产品的需求日益增加。

4、产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，黑曲霉是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一, 柠檬酸的工业生产也通常采用黑曲霉进行的深层发酵法.引入先进技术改进生产方法，降低 成本，增加产量是利用黑曲霉生产柠檬酸的关键。本文就是通过概括性的介绍近年来黑曲霉 利用糖质原料发酵生产柠檬酸的研究新进展，旨在对柠檬酸的产量提高和生产成本降低提供 实验依据，以及为柠檬酸的工业高效生产提供理论参考依据。1工艺研究进展11 固定法黑曲霉利用糖质原料生产柠檬酸 自从固定化细胞技术出现至今的二十多年以来，研究成果层出不穷然而，开发性能良好 的载体和简便的固定化方法仍然是当前酶工程发展中的重要课题固定化细胞技术应用于柠 檬酸

5、生产钟克庭，毛惠英等提出制备固定化活细胞的载体材料是海藻酸钠和卡拉胶，可是这些载 体材料不适用于固定化黑曲霉发酵柠檬酸.去乙酰聚氯基葡萄糖是由B1. 4糖苷键联接的 氨基葡萄糖的聚合锈，它能与卡拉胶和海藻酸钠形成氢键，具有稳定的三维空间，是性能良 好的载体材料.以去乙酰聚氯基葡萄糖、卡拉胶和海藻酸钠的混合胶体作为载体.采用固定 化技术发酵产生柠檬酸，可克服用游离黑曲霉发酵所引起的操作麻烦、细胞利用率低、接种频繁、培养设备容量大、劳务投入大以及成本高等缺点，从而向着设备小、效率高和成本低 的方向发展由海藻酸钠，卡拉胶的混合胶制成的固定化酵母连续发酵稳定性基本稳定，但 该混合胶制成的固定化黑曲霉颗

6、粒，在发酵温度33C、摇床转速220 Y/min条件下发酵柠檬 酸，颗粒容易变松，故此混合胶不能作固定化黑曲霉的载体材料用去乙酰聚氮基葡萄糖 海藻酸钠和卡拉胶的混合胶制成的固定化黑曲霉颗粒，在发酵柠檬酸时，能保持完整颗粒形 状达6个星期以上。 制粒时,可用葡萄糖作为分散剂和增塑剂1。周剑平等人提出利用PVA复合凝胶包埋黑曲霉的抱子及菌丝体。固定后的细胞经过一系刊 预培养，用于发酵玉米生产柠檬酸。试验确定的固定化细胞摇瓶发酵生产柠檬酸最适条件为 玉米糖液浓度10Bx,培养温度35C，摇瓶转速250r/min。经此条件发酵64h，柠檬酸产率 最高达到96g /L,通常稳定在90g / L左右。同时

7、对柠檬酸连续批次发酵生产进行了初步研 究，固定化黑曲霉可连续使用8批敬以上，其柠檬酸产量稳定在86-92 g / L之间，这为柠檬 酸连续发酵提供了有利的保证。而将固定化黑曲霉与传统的游离细胞摇瓶发酵生产柠檬酸对照相比，应用固定化之后再代 谢规律上会发生改变。于是就两种工艺柠檬酸生成及还原糖消耗作对照试验（恒定摇瓶转速 250r/min，初始pH4.5-5.0，糖度为10Bx），结果如图:II丨弋二n韧1凶；t化盅曲矣占诞黑如胞粮瓶丸畔生严种楼釀F撫潮 14；鹿側-：T-! I -话适乂:期朋 醉斓细乱由图可知，经与培养后固定化黑曲霉与游离细胞在柠檬酸生成以及还原糖消耗，PH变化上均 无太大差

8、异，即固定化黑曲霉发酵生产柠檬酸工艺过程基本符合游离细胞摇瓶发酵生产柠檬 酸规律，其变化基本一致。这也表明黑曲霉细胞经固定化后基本不改变游离细胞的代谢规律12 黑曲霉高产菌株的筛选和选育产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，而黑曲霉是迄今为止产柠檬酸最佳的微生 物之一。因此，从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株，并对其培养基的配置及最佳产酸条 件进行探索，研究其性能显得尤为重要，会对今后进一步完善和优化以及筛选工艺提供一定 理论依据。赵琴，李红等人提出利用Aspergiuus nigerAS3. 3928作为对照菌株以废弃苹果榨汁为 底物，设计了四因素四水平的正交实验。在）H为6,温度31C，甲

9、醇含量2%，发酵时间4d 的最适条件下，黑曲霉的发酵最好。将土壤中分离培养获得的20株黑曲霉，选出菌株透明圈 相对较大的Al、A2、A5、A11这4株。在最适条件下，根据4株菌发酵废弃苹果榨汁生产柠檬 酸的情况来进行复筛，得到菌株A2；进而对A2进行鉴定，初步确定所得菌株为黑曲霉。在最 适条件下，A2发酵废弃苹果榨汁其柠檬酸的产量为1. 539 mg / mL，经对A2进行T21紫外诱变， 筛选得到A21。结果表明A21菌株柠檬酸产量比其父本增加了36. 6%，比对照菌株 As3. 3928增加了38. 53%3。而李常建，潘宏以所在学院周围菜园土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并初步对 其

10、进行了形态鉴定。利用透明圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选到 了一株高产柠檬酸的优势菌株。在复筛的过程中，采用单因子试验和正交试验对黑曲霉的培 养基的成分和浓度进行确定。通过分离、初筛和复筛等操作，从土壤中获得一株优势产柠檬 酸的黑曲霉，研究了它的最佳培养基的组成和配比。结果表明，该黑曲霉的最适的发酵培养 基碳源和氮源的组成和配比分别是玉米粉3% 、硫酸氨0. 45%；其最佳产酸条件为：接种 液体种子10%，温度32C，通气量为在250ml的三角瓶装25ml的液体培养基，pH值4. 8,此 时柠檬酸产率为10. 9%。这比一般的筛选方法筛选到的黑曲霉产酸量要高一些，产酸率得

11、到了一定的提高，为柠檬酸液体发酵工业的生产和今后的理论研究提供了一定理论依据，具 有重要的实际意义。在产柠檬酸黑曲霉的分离过程中，人们常以溴甲酚绿指示性平皿培养基上黄色指示圈直 径之比（R值）的大小作为初筛依据，进行大规模淘汰，以提高筛选效率。但R值的大小与产酸 有多大的相关性仍无定论，在小范围内透明圈与菌落的直径之比并不与产酸能力大小简单对 应，它只能作为初筛依据 。因此，需要创新性地设计效率高的科学筛选方案和手段，以达 到最少的工作量，在最短的时间内取得最大筛选效果的目的。本实验所以只以这种方法作为 初筛，复筛时,着重以其最本质的因素（产酸率）作为指标，综合考虑避免实验设计上的错误。 筛选

12、到的高产柠檬酸菌株如何保藏是一个很重要的问题。许多微生物存在自发突变和回复突变，虽然突变的概率比较低：10-8-10-9 之问，但在繁 殖的过程中会表现出来，菌种传代次数越多，产生突变的机率就越大 。因此，要有好的保 藏方法防止菌种退化。中期保藏用到沙土管（霉菌孢子耐干燥能力强），长期保藏用到真空冷 冻干燥保藏，可以保藏十年之久。此外，定期分离纯化和减少传代次数也很重要。定期分离纯化可使菌种的生产性能逐 渐提高，个别适宜的变异可以通过自然选择得到保存和发展 。对柠檬酸生产菌种，人们可 以通过定期分离纯化有意识的筛选个别正变菌就会高产稳产。退化是在繁殖过程中进行的 故要在不影响菌种生理性能的情况

13、下严格控制传代次数。菌种传代的次数越少。它产生突变 的几率就越低4。1.3不同添加剂在黑曲霉柠檬酸发酵的影响 尽管经过几十年的研究，关于柠檬酸发酵机制仍然有很多不够了解的地方，柠檬酸的 合成积累涉及到一系列的酶，它们是相互关联的，影响制约柠檬酸发酵的因子也是多种多样 的，相对来说，发酵培养基中的金属离子以及小分子量的有机物是比较容易控制的因子。但 是每种因子的影响不是绝对的，如金属离子Fe、Mn等，他们并不是可以无条件降低其浓度, 同时它们也是微生物其它正常代谢途径中必须因子，我们只能寻找一个最合适于柠檬酸发酵 的浓度。资料表明：高浓度Mn将刺激乙酰辅酶A,造成草酰乙酸浓度下降，不利于合成柠檬

14、 酸。铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力，培养基中加Cu，有利于达到最高柠檬酸产量。柠檬 酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸， Fe 是乌头酸水合酶专一 激活剂，但柠檬酸发酵开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成做准备，随 后要控制Fe的存在才能开始并大量积累柠檬酸。Johnson等在研究黑曲霉的CO?固定作用时发现有两个CO?固定系统，这两个系统需要 Mg2+、K +2,6,7。也有说几种常见的金属离子对柠檬酸合成酶的抑制作用，且Ca2+Mg2+Na +K+，当然还与离子强度有关o AMP.无机磷和NH4+对磷酸果糖激酶(PFK)有活化作用，NH4+还 能有效的解

15、除柠檬酸和ATP对其抑制，NH “的浓度和柠檬酸生产速度有密切关系。发酵过程 中加入甲醇能明显提高柠檬酸产量。其可能的机理为：甲醇抑制a酮戊二酸脱氢酶活力, 提高丙酮酸羧化酶的活力，增加柠檬酸穿过细胞膜能力，降低胞内柠檬酸浓度，促进柠檬酸 的合成，甲醇还能抑制柠檬酸裂解酶的活力。同时发现，甲醇 对细胞有一定毒性影响。通过对比法，比较九种不同金属盐在不同量对黑曲霉产柠檬酸的影响。如下表所示恚1不同滾度金風盐对产醸影响Tabtel The influence of ditferent concentration metal salts on acid yield祥抽列j、Iy0.01o.ns0.250酬L00空门GuS0+8 358,258J47,S24567.S3MnS044558.839.688*269.859.D0ZnSOiK457.837.457.417.518.02MgSOxB.487.BQ7.767.648.098J5MgCl2S.ll&022119.03S728.22弘朋Gh7J56567.508358.657.95FeSO9.45畑9319.14833875NILC19359.D08,42&引7538.27NaF7.512.050加ai?&2$添加量/mli 1i u B