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1、TRIZOL 试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。接触皮肤之后立即用去垢剂和水 冲洗。若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。收到药品后，在室温下存储。以已证明 TRIZOL 在常温下可稳定储存 12 个月。说明：TRIZOL 是一种从细胞和组织中提取总 RNA 的现用试剂。该试剂是一种苯酚 异硫氰酸酯单相溶液，它发展自 Chomczynski 和 Sacchi 的 RNA 一步抽提法。在 细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整 性。离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。RNA只留在水相中。转移水相 后，用异丙醇沉淀回收RNA。除去水相后，样品中
2、的DNA和蛋白质也可以用后 续沉淀方法回收。用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。DNA 的共纯化可能对样品间 RNA 产量的正常化有用。这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至 50-100mg， 高至lg和细胞（低至5x106，高至107）都有良好的效果。其简单的操作方法 允许同时处理大量样品。整个过程可在 1 小时内完成。用 TRIZOL 提出的总 RNA 不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern电泳分析、斑点杂交、poly （A）+选择、 体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。在PCR和扩大DNA酶I梯度分离中， 建议使用一个内含子中的两个引物
3、。TRIZOL 简化了各种类型的大分子及小分子 RNA 的分离。例如，从鼠肝分离 的 RNA 经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7 到 15kb 的大分子 RNA 条带，（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb （28S）和2kb （18S）核糖体RNA 的条带，以及介于0.1到0.3kb （tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。所分离的RNA 稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。由于其活性难以 抑制，因此只能直接避免其引入。在处理 RNA 时需要注意以下规则。戴一次性手套。皮肤上往往沾有
4、污染 RNA 的细菌或霉菌，并成为 RNase 的 来源。训练良好的微生物学操作方法以避免微生物污染。使用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行 RNA 操作，避免公共用具的 Rnase 交叉污染。例如，用 RNA 探针的实验室一般会用到 RNaseA 或 T1 以降低滤 器背景，而任何不能丢弃的实验用品（如移液枪）可能沾有大量的 RNaseA。TRIZOL 可以有效防止 RnaseA 污染。下游样品的处理需要无 RnaseA 得玻璃 或塑料器皿。玻璃器皿应该在150C下烘烤4小时，塑料制品应用0.5M的NaOH 浸泡 10 分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌。其他注意事项：在装 2ml 体积的
5、 TRIZOL 时，建议用透明的一次性聚丙烯管。用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并试验其能否经受1200gTRIZOL的 离心力以及氯仿的腐蚀。不要使用泄露或有裂缝的管子。离心前小心地称重平衡。离心前玻璃管需用石蜡膜封闭管口，聚丙烯管必需加盖。RNA 分离技术指南警告：使用 TRIZOL 时一定要戴手套和护目镜。避免接触皮肤或衣服。在化 学通风橱操作，避免吸入其蒸气。除特殊情况外，试验操作及试剂存储温度都要求在15-30C。需要但无需补充的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯处理水）不含RNase水或0.5%SDS溶液（不含RNase水的配制：将水加入不含Rnase 玻璃瓶，添加焦
6、碳酸二乙酯至0.01%（v/v）,静置过夜，高压灭菌；SDS溶液的配 制要用焦碳酸二乙酯处理的无菌水。）1匀浆化a. 组织每50-100mg组织加入lmlTRIZOL在玻璃管中用电力匀浆机匀浆化。 取样容积不能超过用于匀浆化的 TRIZOL 的体积的 10%。b. 单层培养细胞将lmlTRIZOL加入3.5cm培养皿，用移液枪吹打几次，直接将细胞消 化。TRIZOL的加入量取决于培养皿的体积（每10cm2加1ml）,而非 细胞数。如果加入不足会造成提取RNA被DNA污染。c. 悬浮培养细胞离心沉淀细胞。在TRIZOL中反复吹打使细胞消化。每5-10x106个动 物、植物或酵母细胞或每5-10x
7、106个细菌细胞加1ml消化剂。在加入 TRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会促进RNA的降解。如果需要破 碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。任选：当处理样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材 料如肌肉、脂肪组织、植物的块茎部分等时，还需要添加额外的分离步骤。 均一化结束后，在2-8C下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部分。 该部分含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪组 织样品需要将上层过剩的脂肪收集除去。每次都将清除过得匀浆液转移到 新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相。2相分离将经过匀浆化处理的样品在15-30C下孵育5分钟，使核蛋白复合体 完全分
8、离。每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿，小心加盖。用手剧烈震管子15 秒，然后在15-30C孵育2-3分钟。在2-8C下以最高12000g离心力离心 15分钟，混合物分为成下层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。 RNA 只存在于水相。水相体积约占均一化 TRIZOL 试剂体积的 60%。3. RNA沉淀将水相转到新管，如果需要分离DNA或蛋白质的话保存有机相。向 水相加入异丙醇沉淀RNA,每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇。在15-30C 下孵化样品10分钟，在2-8C下以最高12000g离心力离心10分钟。通常 不可见的RNA在离心后在管底形成胶状沉淀。4. RNA 洗涤弃去上清
9、。用 75%乙醇洗涤 RNA 一次，每 1ml 每 1mlTRIZOL 加 Iml75%乙醇。涡旋混合样品，并在在2-8C下以最高7500g离心力离心5 分钟。5再溶解 RNA结束时简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）。不要 用真空离心的方法干燥RNA。防止RNA完全干燥非常重要，因为那样会 明显降低RNA的溶解性。部分溶解RNA样品使其A26o/28o比 16。加 入无RNase水或0.5%的SDS溶液，用移液枪吹打几次，在55-60C下孵 育10分钟，溶解沉淀。（如果RNA要用于酶促反应，就要避免加入SDS。） RNA也可以溶于100%的甲酰胺（去离子），-70C保存。RN
10、A 分离注意事项：1. 从少量组织（1-10mg）或细胞（102-104）样品中分离RNA：向组织或细胞 中加入800plTRIZOL,用相同的方法加入氯仿按照相分离第二步操作。用 异丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10yg淀粉作为转入水相的载体。为降低 粘度，在加入氯仿之前现用26计量注射针剪切基因组DNA。淀粉留在水 相与 RNA 一起沉淀出来。当浓缩至 4mg/ml 时淀粉不会抑制单链合成和 PCR。2. 匀浆化之后加入氯仿之前，样品可以存于-60到-70C至少一月。RNA沉 淀（第四步，RNA洗涤）可以保存在75%乙醇2到8C下至少一周或-5 到-20 C下至少一年。3如果第二、三步的离
11、心时间可以达到 30-60 分钟，最高可达2600 的台式 离心机也适用于本实验方案。DNA 分离技术指南如RNA分离实验所述，完全除去水相之后，存在于相界面和酚相的DNA就 可以从原来的匀浆中分离出来。经过沉淀和一系列的洗涤之后，将DNA溶于8mM 的NaOH溶液。TRIZOL可以回收组织或培养细胞的全DNA，因而它可用于测定 待分析样品的DNA含量。同时抽提基因组DNA，使每个基因组对应的Northern 分析结果归一化成为可能，避免了总 RNA 或组织重量变化的影响。（基于不同来 源，有的 DNA 沉淀在使用之前可能还需要进一步的纯化（如酚抽提）。需要但无需补充的试剂：乙醇0.1M柠檬酸
12、钠溶于10%乙醇75%乙醇8mM 的 NaOH1 DNA 沉淀除去留在相界面以上的水相，用乙醇沉淀相界面和有机相中的DNA。每 1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL,加0.3ml无水乙醇，倒置混匀。然后在 15-30C下存储2-3分钟，在2-8C下以最高2000g离心5分钟沉淀DNA。小心除去水相对分离DNA的品质非常重要。2DNA 洗涤除去上层的酚-乙醇，如果需要的话保留以备蛋白分离。在含 0.1M 柠檬 酸钠的10%乙醇中洗涤DNA两次，每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加 lml洗涤溶液。每次洗涤，都将DNA沉淀在洗液中15-30C下保存30分钟（周 期性混合），并在2-8C下以最
13、高2000g离心5分钟。两次离心之后，将DNA 沉淀在 75%乙醇（每 lml TRIZOL ,力口 1.5-2ml75%乙醇）15-30C下保存 10-20 分钟（周期性混合），并在2-8C下以2000g离心5分钟。DNA含量高于200腿的沉淀或大量不含DNA的样品都需要在0.1M钠 的 10%乙醇溶液中再洗涤一次。3再溶解 DNA在开放的管中空气干燥 DNA5-15 分钟。（不要用离心干燥，因为那将造 成溶解困难。）用8mM的NaOH溶解DNA至终浓度为0.2-0.3pg/pl。从107 细胞或50-70mg组织中分离的DNA需要加300-600pl8mM的NaOH。建议将 DNA 重悬于
14、弱碱，因为分离的 DNA 不易重悬于水或 Tris 缓冲液。 8mM 的 NaOH溶液pH约为9, DNA溶解后应该很容易用TE或HEPES调节。在该 阶段，DNA样品（尤其是源于组织的）可能会含有不溶性胶状物质（细胞膜 碎片等）。用12000g离心10分钟除去不溶物，将含DNA的上清移至新管。 溶于8mM的NaOH的DNA可以在4C保存过夜；如果需要延长储存时间， 就需要用HEPES调节pH至7-8 （见表），并补充1mM的EDTA。调好pH 后, DNA可保存于4C或-20C。DNA的定量和期待产率取一部分溶于8mM的NaOH的DNA样品溶液，与水混合，测定所得溶液的 A26o。用双链DN
15、A的A260值计算其含量，一个A260单位相当于50腿双链DNA/ml。 要计算分析样品的细胞数时，可以假定每个人、大鼠、小鼠的二倍体细胞的DNA 含量分别为：7.1yg、6.5yg、5.8yg。应用：用PCR扩增DNA： 用 8mM的NaOH再溶解DNA后，用0.1mM的HEPES 调节pH至8.4 （见表）。加0.1-1.0yg样品到PCR反应混合液，执行标准的PCR 反应。限制性内切反应：用HEPES调节DNA溶液pH至预定值（见表），也可以选 择用1mM, pH7-8的EDTA透析样品。每微克DNA用3-5单位酶。个别酶条件依 照厂家建议，让反应进行3-24小时。在典型的测试试验中，80-90%的DNA是可 消化的。DNA样品溶解的8mM NaOH的pH调节：（1ml8mM 的 NaOH 需用 0.1M 或 1MHEPES 的量）Final pH0.1 M HEPES l)Final pH1 M HEPES (yl)8.4867.2238.2937.0328.01017.81177.5159DNA 分离注意事项：1. 酚相和相界面可在2-8C保存过夜。2. 悬于75%乙醇的样品可在2-8C保存数月。3 .溶于8mM的NaOH的样品可在2-8C保存过夜。需要更长保存时间的话, 要将pH调至7-8，并将EDTA浓度增至1mM。蛋白质分离技术指南蛋白质分离自用乙
