谷氨酸摇瓶发酵

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1、谷氨酸摇瓶发酵生物工程 xxxxxx xxxxxxxxx摘要 根据谷氨酸的发酵机理，本实验通过摇瓶补料发酵生产谷氨酸，并对发酵过程中产谷氨酸量、发酵液 OD 值、残糖量进行连续的测定。试验结果表明：四瓶发酵培养基中，只有添加有玉米浆的发酵培养基产谷氨 酸，另外 3瓶以酵母膏代替玉米浆成分的发酵液都不产谷氨酸。关键词：谷氨酸 发酵 摇瓶培养前言1.1 谷氨酸发酵机制在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反应有三种：（1）谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化 反应；（2）转氨酶（AT）催化的转氨反应；（3）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应。谷氨酸的合成主要途径是a 酮戊二酸的还原性氨基化，是通过谷氨

2、酸脱氢酶完成的。a 酮戊二酸是 谷氨酸合成的直接前体，它来源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间代谢产物。由葡萄糖生物合成谷氨 酸的代谢途径如下图1 所示，至少有16步酶促反应。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制 在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。1.2 谷氨酸生产菌种的选择 目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌、天津短杆菌等。为革兰氏阳性菌，菌体 为球形、短杆状和棒状，不同形状芽孢，没有鞭毛，不能运动，需要生物素作为生长因子，在

3、通气条件下才能 生产谷氨酸。本实验选择天津短杆菌来摇瓶发酵生产谷氨酸。1.3 谷氨酸发酵过程控制谷氨酸发酵过程中，产生菌种的特性、生物素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸 积累的主要因素。在实际生产中只有针对存在的问题，严格控制工艺条件，才能达到稳产、高产的目的。发酵初期，菌体生长迟滞，约24h后即进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，这时必须流加尿素以供给 氮源并调节培养液的pH值至7.58.0,同时保持温度为3032。本阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，菌 体内生物素含量由丰富转为贫乏，时间约12ho随后转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的 a -

4、酮戊二酸和氨主要用来合 成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成最适pH 7.27.4,需大量通气，并将温度提高 到谷氨酸合成最适温度3437C。发酵后期，菌体衰老，糖耗慢，残糖低，这时应减少流加尿素量。当营养物质耗尽，谷氨酸浓度不再增加 时，及时放罐，发酵周期约为30 h。材料和方法2.1 菌种选择：天津短杆菌。2.2 实验器皿的准备：带10ml刻度的比色管24支，离心管12个，枪头灭菌并烘干（80C烘4小时）约200支，灭菌移液管1ml5 支。2.3 配置培养基及相关试剂：2.3.1活化斜面培养基（g/L） （5支，10ml/支）葡萄糖10,蛋白胨10,牛肉膏10,酵母膏5

5、，NaCl12.5，琼脂1520，Ph7.07.2，分装大试管 约10ml/支，灭菌：115C, 25min,斜面高度占试管高度的2/3。2.3.2种子培养基（g/L） （2瓶，30ml/瓶）葡萄糖26,玉米浆40, KHPO 1.4, MgSO 0.8, 20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml培养基（终浓度0.8%,244接种前在无菌室加入），分装30ml/500ml三角瓶，灭菌：115C,25min。在无菌室加入尿素后调节 pH7.07.2。2.3.3摇瓶发酵培养基（g/L） （6瓶，30ml/瓶）葡萄糖 70/80/90,玉米浆（或酵母膏）3, MgSO 0.8, K HPO 3.5,

6、KHPO 1, 20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml424,24培养基（终浓度0.8%，接种前在无菌室加入），分装26ml/500ml三角瓶，灭菌：115C,25min。在 无菌室加入尿素后调节pH7.27.5。2.3.4相关试剂的配制1）0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl溶于蒸馏水并定溶至100ml。2）50%葡萄糖配法：称取50g葡萄糖溶于蒸馏水并定溶至100ml,用于补料。3）20%尿素：称取22g尿素溶于蒸馏水并定溶至100ml,过滤除菌。4）3mol/LHCl：取 12mol/L 浓 HCl,令 HCl:HO 为 1:3 （体积比）配制 100ml。5）2mol/LNaOH:

7、称取8gNaOH固体溶于蒸馏水并定溶至100ml。2.4 实验步骤2.4.1 转接活化斜面：将菌种TG866转接划满活化斜面，32 C培养20h。2.4.2种子培养：向已灭菌的种子培养基加入尿素（1.2ml/瓶），用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至Ph7.07.2。按1ml 生理盐水/1支大试管斜面的用量，将活化斜面上菌种洗下，混匀。按3%的接种量（1ml）接入种子培养基, 9层纱布封口，240rpm, 32C摇瓶培养78h使菌体长至对数生长中后期。2.4.3 测定 od620 值：0h测一次，7h测一次，若OD值净增0.5以上（一般达到0.7以上比较好）则放入冰箱保存待用。接 入

8、发酵培养基时从两瓶中选用一瓶。2.4.4摇瓶补料发酵：向已灭菌的发酵培养基加入尿素，（1.2ml/瓶），用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至Ph7.27.5,将种子 培养基按10%的接种量（3ml）将种子液接入发酵培养基中，9层纱布封口，240rpm, 32C摇瓶发酵约30h。 测定0h的OD62值。2.4.5在无菌台取样0.5ml至离心管中，残液测定pH值,酌情加入尿素0.20.6ml补料，使pH值维持在7.27.5,酌情加入50%的葡萄糖溶液补料（加入量约0.51.2ml,视具体情况而定），使残液维持在2030g/L, 测定。62值和残糖量，每隔3h做一次连续进行至晚上10点，酌

9、情补料。2.4.6每隔 3h 做一次连续进行至 40h。2.5 测定方法2.5.1菌种生长情况吸取0.5ml发酵液于1.5ml离心管中，8000r/min离心3min,上清液用于测量残糖量和谷氨酸产量，沉 淀稀释100倍，用722光栅分光光度计在620nm波长下测其OD值，菌种OD值可以反映菌体的浓度，通 过菌体浓度可知菌体生长情况。2.5.2残糖量和谷氨酸量的测定上（1）中的上清液稀释100倍（取0.1ml稀释至10ml），用生物传感分析仪测定残糖量和谷氨酸 量。2.5.3 pH值的测定6543210987651X处长波值 Du用pH6.48. 0的pH精密试纸测定pH值。实验结果和分析3.

10、1四个梯度的发酵液中OD值变化时间/h葡萄糖100加酵母膏葡萄糖100 酵母膏加葡萄糖70 酵母膏加葡萄糖70 玉米浆加00.8310.8021.2050.89430.9260.891.2770.85861.010.961.3660.84991.0540.9711.4150.95120.9951.011.40.946241.2031.221.4741.082271.4591.061.2081.210D值变化曲线i葡萄糖100加酵母膏 -葡萄糖100加酵母膏 t-葡萄糖70 加酵母膏葡萄糖70加玉米浆36912 15 18 21 24 27 30时间/h图3-1 4个梯度的发酵液中OD值随时间变

11、化曲线图3.2葡萄糖70加酵母膏梯度发酵液中OD值、残糖量及谷氨酸产量变化时间/hOD值残糖量谷氨酸产量01.20518231.27730261.36615291.415192121.4243241.474273271.208243OD OD 1 1豊里酸氨谷、量糖残葡萄糖70加酵母膏曲线变化图-残糖量 谷氨酸产量 OD值图3-2葡萄糖70加酵母膏发酵液中OD值、残糖量及谷氨酸产量随时间（h）变化曲线图3.3葡萄糖70加玉米浆梯度发酵液中OD值、残糖量及谷氨酸产量变时间/hOD值残糖量谷氨酸产量00.89430330.85829560.84927990.952411120.9463412241

12、.0824218271.2074620葡萄糖70加玉米浆曲线变化图1.3001.2001.100-残糖量谷氨酸产量OD 值1.0000.900 值0.7000.6000.5000.800 00369 12 15 18 21 24 27 30时间/h图3-3葡萄糖70加玉米浆发酵液中OD值、残糖量及谷氨酸产量随时间（h）变化曲线图3.3 实验结果分析（1）由图3-1可以看出这4个梯度的发酵液OD值在024h范围内基本上呈现上升趋势，因为菌体的OD值 可以反映菌体的浓度，因此可知在124h内，这4瓶发酵液内菌体生长量都在增加。其中，葡萄糖70加酵母 膏梯度的OD值较其它3个梯度的高，说明其培养基营

13、养丰富，菌体生长较旺盛。到24h后，葡萄糖100加 酵母膏梯度和葡萄糖70加酵母膏梯度的OD值开始下降，而另外两梯度仍有上升，说明此时葡萄糖100加 酵母膏梯度和葡萄糖70加酵母膏梯度发酵液菌体进入衰退期，菌体开始自溶，而另两个梯度的发酵液中菌 体数量仍在增长。（2）这 4 个梯度的发酵培养基中，添加酵母膏的三瓶发酵液均不产酸，另一瓶添加玉米浆的的发酵液产酸， 这是因为在发酵培养基中添加了酵母膏，使得培养基中营养丰富，生物素量过多，酵解途径中的丙酮酸转变为 乳酸，同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸，菌体生长繁殖快，同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物 合成，使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出

14、，谷氨酸合成途径受阻，因而不产酸；而另一瓶添加了玉米浆的 发酵培养基，因其营养成分适宜，生物素处于亚适量，菌体代谢失调，细胞膜通透性增强，细胞内的谷氨酸能 及时排出，有利于谷氨酸的积累，因而产酸量较高。（3）由图3-3可以发现，从3h开始积累谷氨酸，在612h这段时间内残糖量突然下降，而OD值上升较快, 谷氨酸含量曲线相对较平，产酸量较少，是因为产菌速度快，产酸率低；OD值上升快，产菌量多，耗糖快， 主要是因为培养基营养丰富，生物素过量， pH 低，流加液氨不及时。（4）产酸量较少的原因可能是在实验过程中加糖量和加尿素量控制不够合理，从而使残糖量和pH值产生较 大的波动；另一方面也可能是接种量不够或菌种生物活性、温度、培养基营养成分等也有关系。讨论和小结1、在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等因素都会影响到菌体的生长和产酸，因此，应对它们进行调节 和控制如下： 氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发 酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒状杆菌 在溶氧不足时产生的是乳酸或琥珀酸。 温度。菌种生长的最适温度为3032 C。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因 此，在发酵后期，可将温度提高到343