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1、骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩増及表型鉴定间充质干细胞或间充质基质细胞（MSC）是可以从各种来源（包 括骨髓，脂肪组织或脐带）分离的体细胞或成体干细胞。分离的MSC 是表现出位点特异性分化的成纤维细胞样细胞。MSC可能在体内再生 受损或患病的组织，并可能在免疫调节中发挥作用，这为各种临床应 用提供了基础。1:缓冲液准备1.1 PE（ PBS+EDTA）缓冲液，用于分离单核细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2和2mM EDTA制备溶液。低 温（2-8C ）保存。注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配 方A （ ACD-A ）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。1.2
2、PBE（PBS+BSA+EDTA煖冲液，用于分离CD271 +细胞。准备包含磷酸盐缓冲盐水（PBS ）的溶液，用autoMACS冲洗 溶液以1:20的比例稀释MACSBSA储备溶液，可得到pH 7.2、0.5% 的牛血清白蛋白（BSA ）和2 mM EDTA低温（2-8C ）存放。注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配 方A （ ACD-A ）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。BSA可以用其他蛋白 质代替，例如相应的血清白蛋白，相应的血清或胎牛血清（FBS）。 不建议使用含有Ca2 +或Mg2 +的缓冲液或培养基。2:分选单核细胞2.1梯度密度离心Layers before c
3、entrifugation Bone rrarraw sample.1 FiCOllLayers after centrifugationqI I BM MNCs|Ficoll Crarnilocies2.2人骨髓单个核细胞(BM MNCs)的制备 EtythrCiCytS注意：仅使用新鲜骨髓。避免冷冻和解冻骨髓细胞，并在无菌 条件下进行。1. 用针头从髂骨上嵴或胸骨采集骨髓。2. 用缓冲液以7 : 1的比例稀释抽吸的人骨髓，例：用5mL缓冲 液稀释30mL的骨髓，最终体积为35mL。3.100pm过滤器过滤，去除骨碎片和细胞团。(注：使用前， 先用缓冲液的润洗滤器。)4. 将35ml稀释的细
4、胞悬浮液与15ml的Ficoll-Paque混合于50ml 圆锥形瓶中。5. 445g ,20C,离心 35min。6 .除去上清，吸取BM MNCs，至新的50ml圆锥形瓶中。7 .加入40ml缓冲液洗涤细胞，在20C 300g离心10min，弃 上清液。8. 为去除血小板，将细胞颗粒重新悬浮在50mL缓冲液中，20C , 200xg离心10-15min，弃上清液。9. 将细胞颗粒重新悬浮在适量的缓冲液中，以供下游应用。注：骨髓单个核细胞可以在含有0.5%牛血清白蛋白或自体血清 的PBS中保存过夜。细胞在冰箱中保存的时间不要超过一天。在进行 磁性标记之前至少清洗一次，并将细胞重新悬浮在适当的
5、缓冲液中。3. MSCS定量分析推荐使用 MSC Enumeration Kit, huma( 130-106-646 )试剂盒。3.1荧光标记1.准备2支流式管 分别为A管(control sample) B管(MSC sample).分别加入100ul骨髓样本。2 .每个试管中加入20 FCR封闭，冰上暗孵育30min。3.抗体加入设计如下：Experiment setupRack typeChiill 5 Tube Rack, choosepositiSample IDLposition：Control sample 艺position： MSC sampleFlow ratemediu
6、mModestandardUptake volume450 pLSample volume1 mLInstrument settingPBMC compensation (needs to be performed before data anaylsis)*Anriatatians1.position:CD45-FITC( CD23知(GlygphQFin A)VioBlu CD71 (LN(SFR)-PE,igG1-APCr7-AAp $Qlution艺position：CD45-FlTCr CM35a (Gk/cophorin I IE t：1 M MUIHI .Ml 口 I4. 每管加
7、入10ul 7-AAD上机检测。5. 结果展示4. 磁珠分选CD271骨髓来源的人MSC可以通过特定的表面标记(例如CD271 )进 行分离。推荐使用美天旎使用human CD271 MicroBead KIT(130- 099-023)分离 MSC。1:在LS或MS分选柱上放置一个预分离过滤器(30 pm)。2:用PBE缓冲液冲洗色谱柱3次，确保过滤器已预先润湿。3 :将细胞悬液和PBE缓冲液加到柱上的过滤器上4:进行磁性分选。5. MSCS的扩增使用 StemMACS MSC Expansion Media Kit XF (130-104-182) 扩增分离的human MSC ,这是一种
8、经过优化和标准化的完全培养基， 可从骨髓和其他组织来源再生和扩增MSC。5.1 StemMACS MSC Expansion Media Kit XF保持 MSC 良好的 增殖能力。Clo nog icmic pote-ntial usin g StemM ACS MSC Expansion 血dia XFStemMACS M15C： EKpnjioin Modin XF-ii .oxicy1 -SS.OxlO -6.Oxl0z -心-.OxlO70.2x101401.20100BOeo4020FC5-cariLa inin-gi media140.00012D.QOO lQOrQQQ sn.
9、ooo 60.000 40.000 20.000M SC EHparisJorb NurTitwr of CFU-F/wellA Siem-MACS MSC EKp/xIon Media Klc XF； Number of Ml弓匸sZvvellDMIEM + lOfa FC5 m & A! c4 ilcA:在StemMACS MSC扩展培养基XF中培养的MSC表现出更高 的克隆潜力B:与在aMEM+ 5%血小板裂解液中或在含有10%胎牛血清(FCS )的培养基中培养的MSC相比的增殖效率。5.2扩增的MSC非常适合进行免疫调节me-cslM =W7 dswJJ, 40扩增的MSC非常适合进行
10、免疫调节。分离的MSC在StemMACSMSC扩展培养基XF或aMEM+ 5%血小板裂解液中扩增。使用MSCSuppression Inspector通过与MSC共培养的反应性T （ Tresp）细胞 的细胞增殖来测量免疫调节。在该增殖测定中，用荧光染料将Tresp 细胞的质膜染色。随着Tresp细胞的每次分裂，染料被越来越多地稀 释。因此，MFI的降低表明Tresp细胞的增殖率很高。在多克隆刺激 下，仅Tresp细胞显示出强烈的增殖反应。MSC与Tresp细胞的共培 养导致Tresp细胞的增殖减少。在StemMACS MSC扩展培养基XF 中培养的MSC的存在将Tresp细胞增殖抑制至归E刺
11、激的Tresp细胞水 平。5.3保持分化潜能培养基XF中培养的人MSC分化为成骨（A）,成脂（B）或成软骨（C）谱系。在StemMACS MSC扩展培养基XF中培养的细胞具有广 泛的分化潜力。6 . MSC表型验证。现在科研工作者对MSC进行临床研究的兴趣日益浓厚，因此需要 对将其分化为特定细胞类型的机制和过程进行基本了解，并需要对培 养细胞进行MSC表型验证。人体MSC表型鉴定试剂盒基于人MSC 的ISCT （国际细胞疗法学会）标记，可通过流式细胞术轻松地对培养 扩增的MSC进行标准化表型分析。J 7 . MSC功能分析1. CMOFITC2. 匚D44 PE窕 CDl OS PcirC-C
12、yS.54. CD73 AK1 IiwqpcI5I和5L Cells algne& Nlpg 4- Poi ltyp# cofnrol rokiaik7. Neg Pos m a rke f codtaLls日 nd/oir8. Pos isot.烬 comral cotXtaii+ ijpo*1! rsofpetontrol9. Pcs mare*- cocktai I + PE drop in (eg CD毋hMSC7.1分化潜能分化潜能是鉴定和定义MSC群体的有意义的工具。分化为脂肪 细胞，软骨细胞和成骨细胞的程度受MSC来源的影响，因此，例如， 相比于来自脐带的MSC，来自骨髓的MSC
13、具有更大的分化成成骨细 胞的潜力。供体年龄的增加和培养的MSC的传代也降低了分化潜能。StemMACSAdipoDiff，OsteoDiff和 ChondroDiff培养基是人 的最佳分化培养基，适用于从各种组织来源分离的人MSC。每种培养 基均支持扩展的MSC的分化能力分析或质量控制，以及MSC分化过 程的体外研究，包括基因表达和蛋白质谱分析。推荐产品： StemMACS AdipoDiff Media human ( 130-091-677 )； StemMACS OsteoDiff Media human ( 130-091-678 )； StemMACS ChondroDiff Media human( 130-091-679)7.2免疫调节潜能在过去的几年中，科学家将注意力集中在了 MSC的免疫调节潜力 上。已观察到源自骨髓的MSC抑制T细胞增殖。可以使用人MSC Suppression Inspector (人类)抑制MSC的这种功能，其中包含针弟MSC莒曲肓鬲自仝s T so帝就书別-MSC Suppression Inspector human ( 130096207 )8醬常L Di NicoE M2.aL (2002) Bood 99 3838384W2 Barrho-omew、A et aL (2002) ExpHemaOL 3P42148.
