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1、RNA干扰Aurora A表达对人子宫内膜癌细胞的生长与细胞周期的影响作者：滑芳单位：石家庄市，河北医科大学第一医院妇产科【摘要】 目的 探讨应用RNA干扰技术抑制Aurora A基因表达，并研究Aurora A基因表达下调对人子宫内膜癌细胞生长和细胞周期分布的影响。方法 用RNA干扰法抑制Aurora A的蛋白表达，RTPCR及Western blot方法检测Aurora A mRNA和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期分布的变化,四氮唑盐法(MTT)检测转染前后细胞生长抑制率变化。结果 siRNA Aurora A可明显降低Aurora A mRNA和蛋白的表达,siRNA Aurora A
2、导入Ishikawa细胞48 h后,细胞的生长被抑制，细胞周期阻滞于G2/M期和S期；细胞的凋亡率明显升高。结论 下调Aurora A表达可抑制人子宫内膜癌细胞系Ishikawa的增殖,同时导致细胞阻滞于G2/M期及S期并且促进细胞凋亡。 【关键词】 Aurora A激酶 子宫内膜癌 Ishikawa细胞 The effect of siRNA Aurora A on cell growth and cell cycle in human endometrial carcinoma cell in vitro HUA Fang, ZHANG Hongzhen，FANG Guiying,et a
3、l. Department of Gynecology and Obstetrics, The First Hospital of Heibei Medical University, Shijiazhuang 050031 【Abstract】 Objective To address the possibility of Aurora A kinas as a therapeutic target for endometrial carcinoma, we employed siRNA technique to inhibit Aurora A expression and investe
4、gate its effect on tumor growth and cell cycle of Ishikawa cell.Methods Oligo siRNA of Aurora A was synthesized and transfected into Ishikawa cells. Aurora A mRNA expression and protein content were examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and Western blot respectively. Ce
5、ll cycle and apoptosis distribution were observed by flow cytometer. MTT assay was used to evaluate cell inhibition ratio before and after transfection. Results The aurora A mRNA expression and protein content significantly decreased by siRNA of Aurora A. The proliferation of the Ishikawa cells was
6、inhibited by siRNA of Aurora A, along with the induction of accumulation of cells in S phase and the G2/M transition and increased cell apoptosis.Conclusion Inhibition of Aurora A expression can result in the suppression of cell growth and G2/M arrest of human endometrial carcinoma cell in vitro. 【K
7、ey words】 Aurora A kinase; endometrial carcinoma; Ishikawa cell 子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,约占女性癌症总数7%,占女性生殖道恶性肿瘤20%30%,近年来子宫内膜癌在世界范围内发病率有上升趋势。在某些欧美国家子宫内膜癌发病率已居女性生殖道恶性肿瘤首位，其发病机制一直倍受关注。Aurora A 是一种丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶, 其编码基因定位于人类染色体20q13121313;在中心体的成熟、纺锤体的建立及染色体的正常分离过程以及胞质分裂等细胞周期不同阶段的各种事件中都起到了至关重要的作用。自从被发现以来,大量的研究均
8、提示Aurora A激酶与多种人类恶性肿瘤的发生、发展密切相关1,是近年来一个极具前途的肿瘤分子靶向治疗的靶点。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制，目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。我科采用RNAi抑制子宫内膜癌细胞中Aurora A基因的表达,观察由此而引发的生物学效应,从而为其在子宫内膜癌治疗中的可能应用提供实验依据。1 材料与方法1.1 材料 (1)人子宫内膜癌细胞株Ishikawa 购自美国ATCC公司。(2)以Aurora A 基因为靶基因的Ol
9、igo siRNA AuroraA：5AUGCCCUGUCUUACUGUCA3,以及阴性对照siRNA 5UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3均由上海吉玛制药技术有限公司制作。RTPCR引物，Aurora A基因引物上游:5TGGAATATGCACCACTTGGA3’,下游:5ACTGACCACCCAAAATCTGC3’βactin基因作为内参，其上游引物为5CGTGTGGACCTGGCTGGCCGGGAGG3,下游引物为：5CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG3。扩增片断分别为208bps，600bps。(3)RPMI 1640培养基和
10、胰酶均购自GibacoBRL公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；LipofectAM INE 2000，Oligo MEM(均为Invitrogen公司)；RNA 提取试剂盒，RTPCR试剂盒及DNA marker均购自大连TAKARA公司；一抗羊抗人Aurora A多克隆抗体(sc14318)和βactin抗体兔抗人均购自美国Santa Cruz公司；二抗兔抗羊抗体购自北京中山生物有限公司；UNO型PCR扩增仪(Biometre 公司)。1.2 方法1.2.1 细胞培养： Ishikawa细胞生长于含有10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基(含100 U/ml青霉素和100 m
11、g/L链霉素)中,pH值7.27.4，37，5% CO2培养箱中常规孵育,每23天换液传代,取对数生长期的细胞用于实验。1.2.2 实验分组及转染： 根据转染复合物浓度分组:正常对照组(只加脂质体)、阴性对照组(脂质体+阴性Oligo siRNA组)、和siRNA转染组(Aurora A siRNA 转染组)，采用阳离子脂质体转染法转染。用梯浓度的Oligo siRNA转染Ishikawa细胞，得到最佳转染浓度为20 nmol/L,将最佳转染浓度的Oligo siRNA加到50 ml培养瓶。每个培养瓶中接种4×105 Ishikawa细胞，37、5% CO2培养箱中培养48 h后，
12、按实验要求，添加各种试剂进行分析。 1.2.3 RTPCR法检测Aurora A mRNA表达： 逆转录反应为在25μl体系中加4 μg总RNA,42恒温60 min进行反应,94加热5 min灭活逆转录酶,取1 μl逆转录产物为模板进行PCR 扩增;PCR扩增条件为:94 30 s,58 35 s, 72 1 min,共30个循环;最后 72延伸5 min。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,βactin检测逆转录效率,紫外灯下观察结果,凝胶成像系统摄像并分析,以Aurora A与βactin扩增条带的峰面积比值进行mRNA水平的相对定量; Auror
13、a A mRNA表达抑制率=(1-观察组Aurora A mRNA表达强度/正常对照组Aurora A mRNA表达强度)×100%。 1.2.4 Western blot检测Aurora A蛋白表达： 转染后的Ishikawa细胞用PBS洗涤后, 0.25%胰酶消化收集细胞，提取细胞总蛋白,测定蛋白浓度;蛋白样品(60 μg/泳道)及蛋白分子量标准进行12% SDS PAGE电泳,再以150 mA, 1 h将蛋白质电转移到硝酸纤维素(NC)膜上,膜于含5%脱脂奶粉的TBST(50 mmol/L TrisHCL, pH 7.6;150 mmol/L NaCl;0.1% Twe
14、en 20)中4过夜，加入以TBST稀释的抗Aurora A多克隆抗体(1200)和抗βactin抗体(1500)后4放置过夜;次日加入HRP标记二抗(12 000),37摇床下杂交1 h,洗膜后用ECL试剂盒检测,X线胶片曝光、洗片。1.2.5 流式细胞学(FCM) 检测细胞周期和细胞凋亡： 转染48 h 后,搜集的各组细胞用0.25%胰酶消化为单细胞,洗涤后75%冰预冷乙醇-20固定过夜;次日于上机前弃乙醇,PBS洗2次,并细胞计数,最后将细胞数调整至6×105/ml左右,再加入RNA酶及碘化丙啶(PI)至终浓度分别为100 μg/ml和10 μg/ml,
15、 室温避光染色30 min，用Modifit LT软件行细胞增殖周期及细胞凋亡分析。1.2.6 MTT比色分析法测定siRNA Aurora A对Ishikawa细胞生长的抑制： 分组处理24 h、48 h及72 h后,用96孔板，每孔加入MTT 10 μl, 37继续培养4 h,弃去培养液,每孔加入150 μl DMSO,充分震荡10 min,酶标仪测定波长为570 nm (校正波长630 nm)的吸光度值(A) ,每组设4个复孔。根据A值来计算细胞抑制率,细胞生长抑制率IR(%)=(A对照组-实验组)/A对照组×100%。以上实验重复3次,取平均值。1.3 统计学分
16、析 采用SPSS 11.0统计包进行统计处理，计量资料以±s表示，采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Aurora A siRNA对Ishikawa细胞Aurora A mRNA表达的影响 应用RTPCR法检测RNA干扰前后Aurora A基因的转录水平，经计算机图像分析条带的灰度值，得到Aurora A mRNA 表达的相对值。表1中显示转染组细胞相对于对照组Aurora A mRNA 表达的相对值明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。表1 3组细胞中Aurora A mRNA相对值比较（略）注：与siRNA转染组比较，*P0.052.2 Aurora A siRNA对Ishikawa细胞Aurora A蛋白表达的影响 Western
