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1、名称：垂体腺普酸环化酶激活肽(PACAP)作用原理：1. cAMP 依赖的蛋白激酶途径PACAP 与受体结合后激活腺苷酸环化酶，催 化ATP转化为cAMP,后者随之激活 cAMP 依赖蛋白激酶 A (PKA), PKA 又可使胞内多种蛋白质磷酸化,产71生生理作用,尤其是在细胞的增殖分化中有 重要作用,神经酞胺和活性氧族都可 抑制PACAP这一效应。2. 肌醇磷酸脂途径PACAP与受体结合后首先与G 一蛋白偶联使之激活，在磷脂酶C的作用下，磷酯酰肌醇三磷酸水解为肌醇三磷酸 (IP3)和乙酰基甘油(DAG ),IP3SK可 增加胞内钙离子一钙调蛋白依赖性的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶以及酪氨荃激酶的激
2、活,效应。内相应的蛋白质磷酸化,最终产生生理3. 鸟氨酸脱羧酶多胺途径多胺是与正常及肿瘤组织的增生能力 和多种细胞内反应途径均有重要关系的生物活性胺，PACAP与其受体结合后，引起多 胺合成速酶(ODC)表达增强及活性增加，提 高多胺合成，从而使 DNA 合成增加，促进细 胞的增殖，但另一方面，高浓度的PACAP却 可抑制 ODC 的活性。碱基和氨基酸序列：A15TACAGCCACTCGGACGGAATCTTCACGGACAGCTACAG3A25AATCATGCACAGCAGCGTCTACAGCCACTCGGACGGAA3A35CCCTGCTGGTCTATGGGATAATCATGCACAGCA
3、GCGTC3A45TGTAGCGGAGCGAGGCTGGCCCTGCTGGTCTATGGGAT3A55GCCCCGGGATGACCATGTGTAGCGGAGCGAGGCTGG3B13AGAAGTGCCTGTCGATGTCGGCGATAGCCTTTGTTTAC5B23GGCGATAGCCTTTGTTTACCGACAATTCTTTATGAACC5B33CGACAATTCTTTATGAACCGCCGGCAGGATCCCTTTTC5B43GCCGGCAGGATCCCTTTTCCATATTTGTTTCCCAATTT5B53CATATTTGTTTCCCAATTTTTGTTTATTAGATCTGC51 ms
4、skatlall iygiimhysv hcspvglsfp svrlesevyd edgnslpsle ydreqvdars61 ppsdyvytly ypteksggka eedsseplsk rhsdgiftds ysryrkqmav kkylaavlgk121 ryrqrvrnkg rrlayl关于垂体腺普酸环化酶激活肽(PACAP)表达制备的方法：PACAP 及其衍生物与 Trx 的融合表达1) 挑取克隆单菌落接种于 20m1 AmpLB液体培养基中，37C、210r/min震荡培养过夜;2）4%转接过夜培养菌液于30ml Amp +LB液体培 养基中，37C、210r/min震荡培
5、养至 OD二0.70.8，取样1ml为诱导前样品；6003）其余菌液加入终浓度为1mmol/L的诱导剂 IPTG, 32C、210r/min 诱导培养 5h,取样 1ml 为诱导后样品；4）将诱导前、诱导后样品于4C、12000r/min离心 2min，弃上清收集菌体；5) 加 入 160ul 蒸 馏 水 和 40ul LoadingBuffer 重悬菌体；6）沸水浴 10min 之后,12000r/min 离心 1min；7）12% SDS-PAGE检测融合蛋白的表达，上样 量=10ulX% SDS-PAGE 配制方法:分离胶（下层胶）溶液 A（X/3ml ）4.0ml溶液B2.5mlH O
6、 (7.5-X/3ml )23.5ml10% 过硫酸铵50ulTEMED5ul浓缩胶（上层胶）溶液A0.67ml溶液C1mlHO22.3ml10%过硫酸铵30ulTEMED5ulSDS-PAGE 按 LaemmliLaemmli阴法恒压120V 进行不连续凝胶电泳；电泳结束后 ,用考马斯亮蓝R-250 染液染色,再用脱色液脱色至本底无 色。电泳缓冲液配制方法：SDS 1gTris3g甘氨酸14.4gH O 定容至 1000ml。2考马斯亮蓝 R-250 染色液配制方法：考马斯亮蓝 R-250 甲醇1g450ml先用甲醇完全溶解考马斯亮蓝冰醋酸HO100ml450ml2 脱色液配制方法：95%
7、乙醇冰醋酸100ml100mlR-250 粉末,然后再加入HO00ml2）用 Fluorescent Tables Combi-Light 凝 胶成像系统拍照获得凝胶图谱，并采用ImageJ 灰度扫描分析融合蛋白占总蛋白的 百分比。引用：PACAP及其衍生物的克隆表达纯化 和生物学活性研究_张洪丹关于垂体腺普酸环化酶激活肽（PACAP）的 药效检测方法： 采用 RT-PCR 的方法鉴 定CHO表达PACAP基因与鉴定GRF基因过程 基本一致，不同的是模板和引物不同。最后以 DL2000 为分子量标准，用 2%琼脂糖 凝胶电泳鉴定 PCR 结果并拍照。取硝酸纤维膜(0.45 u m),用铅笔作好
8、 加样方格并作好相应标记。(2) 将膜浸入 0.01 mol/LpH7.4 的 PBS 中 15 -30min,取出用滤纸吸干。(3) 将培养的 CHO 细胞上清液，用超滤方法 进行浓缩。用微量加样器吸取样品浓缩液0.5ul于 相 应 的 格 内 ， 室 温 自 然 干 燥 。(5) 将膜片放入封闭液中振荡封闭 30min 。(6) 将膜片放入洗涤液中振荡洗涤 3 次，每 次 3 min 。(7) 用滤纸吸干膜，将该膜置于塑料袋中， 将一抗(山羊抗人) 适当稀释，吸取适量一抗 稀释液于塑料袋中，排除其中的气泡，用封 口机封口，室温振荡30min。或将膜和抗体 稀释放入核酸杂交仪中，25C杂交3
9、0min。(8) 将膜片放入洗涤液中振荡洗涤 3 次，每 次 3 min(9) 将膜片放入酶标记抗体 (马抗山羊 IgG) 液中，杂交方法同(7) 。(10) 将膜片放入洗涤液中振荡洗涤 4次，每 次 3 min 。(11) 将膜片浸入底物液中，在振荡条件下显 色，一般显色 15min。(12) 用流水冲洗数分钟后，放入蒸馏水中终 止反应。并拍照。与单链E.coli5mL 含引用：生长激素释放因子和垂体腺苷酸环化 酶激活肽基因的共表达_刘松财 垂体腺普酸环化酶激活肽( PACAP 抗体融合的例子： 表达质粒分别转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS+，挑取单克隆于 50mg/mL卡那霉素的LB培养基，摇菌培养过 夜，以 1:20 接于 500mg/mL 卡那霉素的 LB 培养基，37C摇菌至A为0.3-0. 5,加入 IPTG 至终浓度 0.3mno1/L, 300C 诱导 3h。离心收集菌体, 20mmo1/LTris-HC1(pH7.5) 重悬,冰浴中超声破碎,离心 19000gX30min, 取上清SDS-PAGE检测可溶性。引用：重组人垂体腺苷酸环化酶激活多肽及 _省略_生多肽的研制_生物功能筛选及鉴定
