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1、浅论单纯过量醛固酮在正盐饮食下导致SD大鼠心肌受损【摘要】 【目的】 探讨单纯过量醛固酮在正盐饮食和正常血钾情况下对SD大鼠心肌结构的影响及其可能机制。【方法】 正盐饮食和补钾情况下，雄性SD大鼠随机分3组：对照组、醛固酮组和醛固酮 + 安体舒通组，每组10只。观察4周，每周测量血压，实验结束时观察心肌结构改变，比色法测定血清和心肌丙二醛(MDA)水平和过氧化物歧化酶(SOD)活性，ELISA法测定血清超敏C反应蛋白(hsCRP)水平，免疫组化法检测心肌ED-1表达，实时荧光PCR法检测p47phox和p22phox 基因表达。【结果】 醛固酮作用4周，SD大鼠血压轻微上升(P)，但心肌超微结
2、构已有改变;同时，血清和心肌MDA水平和SOD活性、心肌p47phox基因表达以及血清hsCRP水平均增加(P均)，但心脏局部未见炎症细胞浸润。安体舒通可逆转醛固酮的影响，且不完全依赖血压的下降。【结论】 单纯过量醛固酮在正盐饮食和正常血钾情况下可引起SD大鼠心肌受损和氧化应激反应增强，这些变化先于心脏局部炎症反应的出现。【关键词】 醛固酮; 心脏; 氧化应激; 盐皮质激素受体Abstract： 【Objective】 To investigate the direct cardiac injury of aldosterone alone in SD rats under normal sa
3、lt diet and normokalemia and its possible mechanism. 【Methods】 Male SD rats receiving normal salt diet and potassium chloride supplementation for 4 weeks were divided into three groups (n = 10 in each group)： control; aldosterone infusion; aldosterone infusion plus spironolactone. Systolic blood pre
4、ssure (SBP) was measured every week. At the end of experiment， the myocardial structure was observed， malonaldehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) activity in serum and cardiac tissue were estimated by colorimetry， serum hsCRP concentration was assayed by ELISA， ED-1 expression of myocardium w
5、as analyzed by immunohistochemistry， p47phox and p22phox mRNA expression were measured using real-time RT-PCR. 【Results】 Aldosterone， under a normal salt diet and normokalemia， induced only a slight increase in the SBP of SD rats (P). However， aldosterone significantly induced cardiac ultrastructure
6、 changes. Furthermore， aldosterone increased MDA formation and SOD activity in serum and heart tissue (P)， increased the level of serum hsCRP and the expression of cardiac p47phox mRNA (P). Simultaneously， no significant infiltration of monocyte/macrophage can be seen in the mesenchyme of myocardium
7、. The effect of aldosterone was reversed by spironolactone， which was partly independent of SBP. 【Conclusion】 Excess aldosterone alone can induce cardiac damage and severe oxidative stress response before emergence of inflammation， even in the absence of salt loading and hypokalemia.原发性醛固酮增多症目前被认为并不
8、是一种少见病，它在高血压患者中所占比率远比以往认为的多，达到了10%甚至更高1。与同等血压的原发性高血压患者相比，原发性醛固酮增多症患者心脏损伤发生早、程度重，且这些损伤独立于血压升高。但高醛固酮血症导致心脏损伤的具体机制尚不明确。既往动物实验显示过量醛固酮可通过氧化应激和炎症等途径导致心脏损伤3，4，但这些研究多是在合并高钠饮食(不小于10 g/L NaCl)、单侧肾切除或者二者结合的模型上进行的，并没有排除高钠饮食和单侧肾切除对心脏的作用。尽管后续Yoshida等在正盐饮食(5 g/L NaCl) (百分比浓度需要换算)以及保留双肾的情况下，发现醛固酮仍可导致SD大鼠心肌结构受损，但该研究
9、依然未排除醛固酮所致低血钾对心肌的影响。因此，过量醛固酮所介导的心脏损害是单纯醛固酮的作用，还是掺杂了高钠饮食、单侧肾切除以及低血钾的影响还不得而知。所以，有必要在排除这些混杂因素的情况下，研究单纯过量醛固酮是否对心肌产生损伤以及其可能机制。1 材料与方法动物与主要试剂雄性SD大鼠30只，体质量180 200 g，由中山大学动物实验中心提供。醛固酮(Sigma公司)，安体舒通(杭州民生药业)，ED-1单克隆抗体(Millipore公司)，丙二醛(malonaldehyde，MDA)、过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司)，超
10、敏C反应蛋白(hsCRP)检测试剂盒( 武汉中美生命科学技术公司)，Trizol(Invitrogen公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)，肾素活性检测试剂盒(DiaSorin公司)，醛固酮浓度检测试剂盒(DSL公司)，免疫组化试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，其余试剂为国产分析纯。方 法实验分组SD大鼠随机分为3组，每组10只。所有大鼠均自由摄食(含5 g/L NaCl)。为防止醛固酮造成的低钾血症，自由饮用4 g/L氯化钾水。正常对照组(CON)：100 g/L水合氯醛( mL/100 g)腹腔麻醉后，把装有50 mL/L乙醇的微泵(2004型，美国Alzet公司)植入
11、大鼠颈后皮下组织。醛固酮组(ALD)：醛固酮溶解在50 mL/L的乙醇中，装入微泵植入大鼠颈后皮下组织，以 g/h的速度持续皮下输注。醛固酮+安体舒通组(SPI)：皮下输注醛固酮，同时予以安体舒通100 mgkg-1day-1灌胃。所有大鼠观察4周。体质量和血压监测实验开始以及此后每周测量体质量和血压。血压采用tail-cuff法测量清醒状态下收缩压(SBP)(BP-98A动物无创血压监测仪，Softron公司，日本)。标本收集实验结束前一天，大鼠被置于代谢笼中，饮食和饮水同前，分别收集24 h尿液，记录24 h摄食量、尿量，测定24 h尿钠、尿钾排出量。实验结束当日，100 g/L水合氯醛腹
12、腔麻醉( mL/100 g)，腹主动脉穿刺取血，快速分离心脏，切取1 mm3大小的组织块放于戊二醛中固定，经锇酸二次固定，Epon树脂包埋，制成超薄切片，用饱和醋酸铀和10 g/L柠檬酸铅双染，透射电子显微镜(Philips CM10， Holland)观察心肌超微结构改变。心尖以上 cm处水平切取厚约 cm的心肌组织放于多聚甲醛中固定，制成石蜡切片，用于HE染色和免疫组化分析。余下心肌组织用液氮速冻后，放-80 保存用于蛋白和总RNA提取。免疫组化法检测心肌ED-1表达心肌组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，分别经胰酶抗原修复，30 mL/L过氧化氢避光孵育15 min，正常山羊血清室温
13、封闭1 h，孵育抗ED-1抗体(1：50) 4 过夜，PBS冲洗后孵育辣根过氧化物酶标记的二抗工作液37 1 h，DAB显色，显微镜下观察：阳性表达部分呈棕黄色，去离子水终止显色。然后依次苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片。设立阴性对照，一抗用PBS代替，其他步骤相同。血清和心肌氧化应激指标的测定MDA水平和SOD活性可反映氧化应激水平。MDA水平采用硫代巴比妥酸比色法测定，SOD活性采用化学比色法测定，操作按试剂盒说明书进行。ELISA测定血清hsCRP浓度血中hsCRP水平反映机体炎症反应程度。具体操作步骤见试剂盒说明书。每个样本均设复孔，分别建立标准对照和阴性对照。实时荧
14、光定量PCR测定心肌NADPH氧化酶亚基p47phox和p22phox mRNA的表达用Trizol提取总RNA，检测总RNA纯度和浓度，然后进行反转录。按SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit(DRR063S，TaKaRa，日本)的操作说明进行，首先1 g总RNA为模板，反应体积20 L进行逆转录，反应条件为37 15 min，85 5 sec。再以RT产物为模板，用SYBR GREEN染料法进行Realtime PCR(LC480，罗氏)扩增目的片段，GAPDH作为内参照。引物(宝生物工程有限公司合成)序列p47phox 5-GGCAGGACCTGTCGGA GAAGG
15、TGG-3 (forward primer) 和5-TGAAGGA TGATGGGGCCTGTGATG-3(reverse primer);p22phox 5-TGCGGGACGCTTCACGCAGTGG-3(forward primer)和5-GGTTGGTAGGTGGCTGCTTGATGG-3(reverse primer);GAPDH 5-GGCACAGTCAAGGC TGAGAATG-3(forward primer)和 5-ATGGTGGT GAAGACGCCAGTA-3(reverse primer)。引物浓度10 mol/L，反应体积20 L，PCR采用两步法，第一步95 预变性
16、10 sec，第二步95 5 sec，60 31 sec，共40个循环，用Ct法计算相对量。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线。统计学方法数据均用均数 标准差表示，应用SPSS 进行统计学分析，组间对比采用单因素方差分析，显着性水平P。2 结 果基本实验指标的检测醛固酮皮下输注4周，ALD和SPI组血清醛固酮水平高于CON组(P，表1)，而血浆肾素活性低于CON组(P)，说明低肾素性醛固酮增多症的大鼠模型造模成功。实验结束时，各组体质量差异无统计学意义(P)，三组血钾均在正常范围内。实验第2周ALD组大鼠死亡1只，原因不明。大鼠收缩压变化情况三组基础收缩压差异无统计学意义(P)。第1周开始ALD组收缩压升高至(127 9) mmHg(P)并维持到第4 W实
