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1、ABO、RhD血型鉴定操作规程一、 目的指导规范本科工作人员进行血液ABO、RhD血型鉴定工作。二、 适用范围输血岗位工作人员。三、 职责负责对申请输血的标本进行ABO、RhD血型鉴定。四、 标本2mlEDTA-K2抗凝全血。五、 实验器材载玻片、0.510ul加样枪、20200ul加样枪、1001000ul加样枪、一次性吸头、台式离心机、小试管、微柱凝胶离心机、记号笔等。六、 实验试剂抗-A、抗-B血型定型试剂（单克隆抗体），RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）；0.5%1%A、B标准红细胞盐水悬液；ABO、RhD血型定型检测卡；0.9%生理盐水。七、 检测原理血型鉴定，是根据IgM类
2、特异性血型抗体与红细胞膜上特异性抗原结合，能出现凝集反应的原理，用已知IgM类特异性抗-A、抗-B和RhD标准血清来检测红细胞上有无相应的特异性抗原；而反定型，是同时用标准A红细胞和B红细胞来检测被检血浆（清）中有无相应的天然IgM类抗-A或抗-B。微胶凝柱卡是采用排阻层析原理，在微胶凝柱介质中，红细胞抗原与相应抗体结合，形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，该复合物不能通过凝胶间隙而浮于胶表面或悬于胶中；如无相应抗体结合，则不能形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，分散的红细胞可以通过凝胶间隙沉于微柱腔底部。八、 操作流程1、 玻片法1.1 查抗原：取洁净载玻片一张，用记号笔标注好A、B、R
3、h，分别向所标注位置加5ul待检全血，再向相应位置滴加抗-A、抗-B、RhD标准血清一滴，混匀。1.2 查抗体：台式离心机 3000r/min离心待检标本2min，上清备用。取洁净载玻片一张，记号笔标注Ac、Bc，相应加入A型、B型标准红细胞一滴，再分别加入待检血浆（清）20ul，混匀。1.3 将玻片不断轻轻转动，使血清与红细胞充分混匀，连续15min，肉眼观察有无凝集反应。如肉眼观察无凝集，则用显微镜观察有无凝集或溶血。2、 微胶凝柱法2.1标本准备：待检全血3000r/min离心2min，上清液为待检血浆；取压积红细胞10ul加入1000ul生理盐水中制成待检红细胞悬液，在试管上做好标记。
4、2.2标注微柱凝胶卡（受检者信息及检测时间）。2.3将备好的待检红细胞悬液分别加入前4支微柱腔（抗-A、抗-B、RhD、对照），每孔50ul。2.4将待检血清（浆）分别加入后两支微柱凝胶腔中（中性），每孔50ul。2.5将已知A型和B型红细胞0.5%1.0%浓度悬液50ul分别加入第五和第六支微管中。2.6即刻用专用微柱凝胶离心机离心5min，取出肉眼观察，判定结果。2.7结果判定：阴性不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱底部；阳性出现特异性抗原抗体复合物，红细胞浮在凝胶表面或胶中。九、 ABO、RhD标准血型谱血型抗-A抗-BRhD对照AcBcA型RhD（+）+-+-+B型RhD（+）
5、-+-+-O型RhD（+）-+-+AB型RhD（+）+-A型RhD（-）+-+B型RhD（-）-+-O型RhD（-）-+AB型RhD（-）+-十、 注意事项1. 严格按照操作规程进行作业，认真核对标本并做好相应标记。2. 所用玻片、吸头、试管必须清洁干净，防止溶血。3. 一般先加血清，后加红细胞，以便核实是否漏加血清。4. 所有试剂用完应放回冰箱保存，以免细菌污染，影响试剂实验结果。5. 微胶凝柱卡必须在使用前离心。6. 红悬液浓度控制在0.5%1.0%范围内，浓度过高或过低均会引起异常结果。7. 红细胞标本不能被细菌污染，否则会出现假阳性反应。尽可能用当日采集新鲜血做，若不得不用陈旧血，则必
6、须先做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。8. 如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不能排除其他原因所致溶血，对此标本一定要认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。9. 判读结果后一定要仔细核对，做好标记和记录，避免笔误。10. 出现正反定型不符时，要重新核对，并严格按照操作规程重做一遍该实验。如果受检者是婴儿或者肿瘤患者，理论上应该检测到的抗体没有检测到，可以忽略不计，以检测到的抗原定型。如果受检者不是婴儿或肿瘤患者，则可将加样完成的微胶凝柱卡置于4或37环境15分钟，再离心观察结果。十一、 方法学评价1. 玻片法定型简单，不需要离心设备，适用于大规模血型普查。该法仅靠抗体的力量凝聚红细胞，无离心力加速反应，不适用于交叉合血。2. 凝胶微柱卡定型，使用安全，操作简单，结果稳定可靠，灵敏度高，重复性好，但费用昂贵，需要特殊离心设备。十二、 参考文献1. 李勇，杨贵贞.1999.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.北京：中国科学技术出版社.2. 李勇，马学严.2006.实用血液免疫学.北京：科学出版社.3. 叶应妩，王毓三，申子瑜.2006.全国临床检验操作规程(第三版).南京：东南大学出版社.
