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1、紫外-可见光检测器第一节 工作原理和主要性能一、工作原理1. 朗伯-比耳定律紫外-可见光检测器是通过测定样品在检测池中吸收紫外-可见光的大小来确定 样品含量的。该检测器测量的是物质对光的吸收，属于吸收光谱分析类型的仪器， 无论采取什么设计方法，其工作原理都是基于光的吸收定律朗伯-比耳定律。该定 律指出，当一束单色光辐射通过物质溶液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光 度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。4 _ air _ Lgy _ lgy/ -人严T -S式中，I是透过光强度，Io是入射光强度，T为透过率，A为吸光度(absorbance)， 又称光密度(optical density
2、: 0D)或消光值(extinction, E)，b是光在溶液中经过的距 离，一般为吸收池厚度，c是吸光物质溶液的浓度，a为吸光系数。如果溶液浓度 单位采用mol/L，b的单位为cm，则相应的吸光系数为摩尔吸光系数(molar absorptivity)或摩尔消光系数，单位为L/(molcm)，用符号表示，则A - shei 4 一 3 - 1)由上式可见，吸光度与吸光系数、溶液浓度和光路长度成直线关系，也就是说对 于给定的检测池(此时b 一定)，在固定的波长下(为定值)，紫外-可见光检测 器应输出一个与样品浓度(c)成正比的光吸收信号一一吸光度(A)。而实际上检测器 光电元件的输出信号与透过
3、率成正比，所以为了定量计算方便，在仪器采用对数 放大器，将透过率转换成吸光度，此时仪器输出信号与样品浓度成正比。故紫外- 可见光检测器属于浓度敏感型检测器。2. 摩尔吸光系数与分子结构紫外-可见光检测器的灵敏度很大程度上取决于样品的摩尔吸光系数。摩尔吸 光系数表明物质分子对特定波长辐射的吸收能力，是物质的重要特性。的大小与 物质的分子结构、波长有关，不同类型物质的值差别很大。这是由于这些物质分 子中某些基团的存在。当用光照射时，基团中的电子吸收光能发生能级改变，同 时伴随着振动和转动能级的改变，形成特征的强吸收带。这些基团称作生色团(或 发色团)，它们都含有不饱和键或未共用电子对，如CC、C0
4、、SC、CN、NN、N0等，能产生n-n及n-n的跃迁。由于跃迁时吸收的能量较低，在近紫外区和可见光区出现吸收。不饱和键的存在是有机物发色（指在 200 nm-1000 nm 波长光谱区内产生吸收峰）的主要条件。另外，某些基因本身不产生吸收峰，但与生色团相连时，常常引起吸收峰位 移和吸收强度改变，这些基团称为助色团。主要的助色团有羟基、烃氧基、氨基、 烷氧基、芳氨基等。这些基团都能引起氧原子上或氮原子上未共用电子的共轭作 用，由于助色团的存在，使生成因吸收峰的波长向长波方向移动。表4-3-1列出了 各类有机化合物及基团的紫外光谱区的最大吸收波长和相应的摩尔吸光系数。除 有机化合物外，许多金属离
5、子和非金属离子也可利用紫外-可见光吸收进行检测。表4-3-1 一些发色基团的最大吸收波长九max和相应的摩尔吸光系数发色团系统c/(L*Tnor*cin J )1 *cm 1 )醸基-O-1851000S19446002151600胺基VLIS2SO)J 95J 400一硫化物SS194550025540)漠化物Br20S300碘化物126040G睛16()二烘此物m:175 ISO6(X)0SC),180XOII19()5000叠氮址掬19()5(X)0/烯烽类X/(：=(：/ mSO(X)關X c=o/1951000270- 285IS-30X/205强酯一 COOR20550醛(JiO2
6、10强30011 IS比色团京统X：iui Fm、eAL-timl 1rm1 e/ Lniol 1 rtn 12OQ-2JQ5A-7Q亚飙2101500硝基化合物一桃210强亚硝醴墮0X()220 “23GJ(W-2(X)0300-JOOJO偶氮-235-40035苯1嗣467002()269()0场KXW2201I200D2757W25219900037579()0紫外-可见光检测器传统上只能检测具有紫外-可见光吸收的物质。近年来发展 的间接光度色谱，采用一般的紫外-可见光检测器，检测非紫外-可见光吸收物质， 使其应用范围扩大。3. 检测波长测定时一般都选择在对样品有最大吸收的波长下进行，以
7、获得最大的灵敏度 和抗干扰能力。但应特别注意在选择测定波长时，必须考虑到所使用的流动相的 紫外吸收性质。也就是说，使用紫外） 可见光检测器时，溶剂不应吸收测定波长的 紫外光，样品测定波长应当在溶剂紫外吸收波长上限以上，噪声降至 10-410-5AU， 才能保证检测的灵敏度，才能用于梯度洗脱。溶剂吸收波长的上限，就是透过波长的下限。表 4-3-2 列出了液相色谱中常用 溶剂透过波长的下限。波长的下限规定为溶剂在以空气为参比，样品池厚度为 1cm 的条件下，恰好产生 1.0 吸光度时相对应的波长值，即溶剂透过率为 10%时的波长。溶剂中如果含有吸收紫外光的杂质，同样会使检测背景提高，灵敏度降低，
8、且用作梯度洗脱时会引起严重漂移。因此，液相色谱系统对溶剂纯度要求较高， 一般应使用分光纯或分析纯溶剂，在有条件时，色谱纯溶剂为首选。应注意不能 使用化学纯及纯度更低的溶剂。有时需要对溶剂进行专门纯化处理。常剂轻称2102旳2202102102。21023()30527T)28?29()21021G12.)210表 4 - 3 - 2 常用溶剂透过波长下限透过波栓下帥呦4.理论估算检测限各种物质的摩尔吸光系数差别很大，因此检测灵敏度也有较大不同。根据朗港it渡氏下限丿晌|港削名称乙睛苯二湄甲烷 菇酸丁酩 TE 二磕化碳四氯化碳环己烷氯乙烷 二氯甲烷 甲醴替二胺二氧六环 二乙瞇 坏戍饶甲确甲苯氯代
9、再烷 二乙SS甲醸乙酯乙殿乙酯I甘油|庚烷己烷|甲爵I甲基环己烧I甲輟甲酯|鞘基甲烷正戍烷-异丙肆I吐哩I囲眾代乙烯I甲苯I间二甲苯| 2.2,4-三甲基戊烷 异辛烷乙SSI甲螢异丁酶四氢咲喃伯-比耳定律，可从理论上估算紫外-可见光检测器的检测限、最小检测量和最低检测浓度。表 4-3-3 列出了紫外 -见光检测器对不同类型化合物的理论检测限、最小检测量的估算值。20苯io-2002200002.Sx1.6x 1旷10 90 x 10 JJ表 4 - 3 -3 紫外吸收检测器的理论检测限疑小检测量/0弾L检注池）检漁限/（附汕】喋宙水平4 10丸）苯甲醛I iom3.8x JO3.5x 10 u
10、饱和按垦化合物二、检测器的性能（一）噪声和漂移光学吸收检测器的噪声主要来源于检测器和分离系统两方面。最常用的确定 噪声来源的方法是系统地改变流动相的流速，如果噪声与流速变化正相关，则噪 声可能来源于分离系统；当噪声与流速变化严格成正比关系时，可以确定噪声一 定来源于分离系统。1. 来源于检测器的噪声对于光学吸收检测器，当没有样品吸收时，检测信号是与波长有关的光强、 光学系统的传播效率和光电转换效率的函数。如果光电转换效率低，则输出信号 小，接近于光电转换元件的自然噪声。可以通过采用强光源或宽谱带的办法来增 加光强，提高信噪比。如果仅提高放大器的放大倍数，会同时放大噪声，信噪比 也得不到提高。许
11、多光学吸收检测器使用氘灯做光源，随着使用时间的增加，氘 灯光强降低，噪声不断加大。另外，由于静电作用，检测器在使用过程中易于从 周围环境中吸尘，覆盖在光学元件上的尘埃降低了光的传播效率，提高光的散射， 因此对检测不利。强紫外光的照射还会使一些光学材料徐层发生降解，也会慢慢 增加噪声。检测器的信噪比一年可降低四分之一或更多。2. 来源于分离系统的噪声早期紫外-可见光检测器对流动相流速的变化非常敏感，因此也导致了恒流泵 的使用和发展。温度变化引起流动相折射率改变是紫外-可见光检测器流速灵敏度 产生的主要原因。入射光进入检测池之前必须通过空气-光窗和光窗-流动相两个界 面，入射光因此产生了反射或散射
12、损失，具有与化合物吸光相同的效果（大约是 10-4）。当介质之间折射率的差异较大时，会有更多的光被反射、散射损失掉。由于 折射率对温度的变化非常敏感（大多数溶剂折射率的温度系数在 10-4-10-3 之间）， 因此需要控制检测池流动相的温度，利用热平衡减少光损失。热交换器是热平衡 的典型设备。除温度外，流动相折射率的变化还与其压力有关。泵的脉冲导致流 动相压力变化，也会引起流动相折射率的改变，而影响通过流动相的紫外光传播。 可以用增加脉冲阻尼器的方法来改善压力基线噪声。检测池内气泡的存在，是检测器噪声的重要来源。原因是检测池内一个很微 小的气泡都会形成一个反射面，造成光的反射、散射损失，引起吸
13、光误差。使用 经充分脱气的流动相通过检测池可以避免气泡。提高检测池压力，是防止气泡形 成的较好办法。具体做法是在检测器出口设置限制器（lm*0.25 mm聚四氟乙烯管）, 使之保持一定的反压；或者在检测器出口处接一根旧的短柱。但应注意增加的压 力不能太高，如果超过规定的压力限，可能引起检测池的破裂，色谱参数也可能 发生变化。气泡内含氧时，在波长小于 260 mm 处经常可以观察到很高的噪声水平， 此时流动相用氦气脱气是消除水平噪声的有效手段。除了会引起检测器产生噪声外，流动相温度的缓慢变化、光学元件如光源等 的迅速老化还会引起检测器的漂移。现代紫外-可见光检测器的漂移更多的来自流 动相组成的改
14、变，尤其是进行梯度洗脱时。为弥补梯度洗脱造成的漂移，可采用 双柱分离、双光束检测的办法以差减去除漂移，但操作繁琐；或者将含有样品的 流动相和不含样品的空白流动相先后进行同样的梯度洗脱，将两者差减后，去除 漂移。另外，还可用化学方法加入负梯度物质，进行负向补偿流动相溶剂造成的 基线漂移。但此时由于本底提高，要求紫外-可见光检测器有较大的线性范围。（二）线性范围朗伯-比耳定律只适用于单色光和均匀非散射溶液。对于连续光源，当单色器 色散能力较低时，得到的是具有一定波长范围的较宽谱带，吸光系数近似为常数， 导致对定律的偏离。不仅使线性范围变小，而且吸收峰不敏锐。朗伯-比耳定律中 的仪器偏差是定量分析的根本性限制。当待测物质浓度较大时，这种偏差表现为 响应曲线的斜率变小
