《建立检验方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《建立检验方法（20页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、健康食品之促進鐵吸收功能評估方法衛署食字第 0950405557 號公告附件一、背景明 (1-16) 根據合國農組織與世界衛生組織 (FAO/WHO) 之報告，缺鐵仍是 可忽視的營養缺乏問題之一，除盛於經濟後與開發中國家之外，在經濟 富裕之歐美先進國家也沒有完全解決。缺鐵的定義是體內鐵儲存耗竭，並且增 加貧血的危險，而貧血是缺鐵末期的症。美國自 1943 開始強制實麵粉營 養強化措施，添加的營養素包括維生素 B1、B2、菸鹼素與鐵，然而根據美國最 新之健康調查 NHANES III (1988-1994)，美國缺鐵盛以生育齡性有9-11%最高，其次是 1-2 歲幼兒 9%， 50 歲以上性也有
2、 5-7%之多，男性缺鐵則 低於 2%。瑞典之調查指出其青少之缺鐵盛超過15% ，性甚至高達40%。我國第一次國民營養健康況變遷調查同時用血鐵蛋白濃、運鐵 蛋白飽和和血紅素濃等血液指標評估鐵營養況。四歲以上國人之總缺鐵為男性 2.1%，性 10.7%；鐵儲存耗盡之比為男性 1.3%，性 7.7%；缺鐵 貧血為男性 0.2%，性 2.1%；國人缺鐵問題與歐美國家同，是以無床 症之缺鐵為主，並且有明顯的性別差，以性較男性為嚴重。除65 歲以上人性之缺鐵均高之外，男性缺鐵最高的是13-18 歲，與青春期之快速成長有關；性則從 13-64 歲有 9%以上之缺鐵，以 30-50 歲有 14.2%最 高，
3、快速成長與月經有重要的影響，另外因體重控制而減少攝食或食物選 用當，也可能增加缺鐵之危險。缺鐵為一漸進而續的變化過程，初期為體內儲存之鐵耗盡，進而使血液中 運送之鐵短缺，逐漸敷造血組織之需要，最後導致血紅素之合成足，而造 成貧血症。因此，缺鐵可分為無貧血性缺鐵與缺鐵性貧血大。貧血發生之前，通常沒有明顯辨之症。貧血發生之後，多種生機能之症就明顯可辨，如：肌肉動效明顯低，無法從事劇短促的活 動，影響肌肉的生和能代謝效，增加心臟的負荷等。缺鐵貧血與嬰幼兒 性運動能有關，並且有為常的現象，使心智發展明顯較差，包 括：語言能差，運動協調與平衡佳，注意、反應敏與情緒的分均 明顯較低，甚至有長期的影響，因為
4、長期追蹤發現，缺鐵貧血幼兒於五或十 後其認知能與學習成就仍然較為低。無貧血性缺鐵也會低認知能，缺鐵之高中生經過鐵補充之後，可以提 升其語言學習與記憶能。美國 NHANES III 調查中發現， 6-16 歲兒童青少 中，缺鐵者的學得分顯著較健康者為低，風險比(odds ratio) 高達 2.3。富裕社會中無貧血性缺鐵盛仍然居高，由於涉及學習發展，故對兒童青少 的鐵營養況必須密注意。缺鐵影響免疫機能，根據人體與動物實驗證實，缺鐵主要影響項免疫功 能：中性白血球吞噬細菌能低，T 巴細胞對細胞增生劑或抗原的反應 低。缺鐵還會增加鉛中毒的危險，美國兒童中缺鐵者鉛中毒的比較健康者高 出 34 倍。因為
5、缺鐵時小腸負責鐵吸收的蛋白質 DMT1 表現增加，但是它缺乏 專一性，故對其他二價屬元素，包括鉛、鉻等重屬的吸收也伴隨增高。國人缺鐵問題仍然存在，我國並未全面實食物加鐵強化之措施，因為缺鐵 問題有個人之差，並非人人需要補鐵，而且體內鐵儲存大幅增加並增添 處。因此發展各種補鐵食品以供消費者依個人需要選用，配合個人日常飲食以 維護鐵營養之充足，有其積極正面之意義。已知影響鐵吸收的主要因素有鐵的化學形式與鐵可用(bioavailability)。鐵的化學形式主要區分為血鐵質(heme iron )與非血鐵質(non-heme iron)種。血鐵質主要自肉，其吸收受其他飲食成分的影響，但是 受鐵營養況
6、之調節，吸收平均25%，缺鐵時可提高到 40% ，鐵充足時可到 10%。長時間高溫烹調會使血鐵質分解成非血鐵質。非鐵血質 自各種植物性食品，鐵蛋白 (ferritin) 以及鐵補充劑等等，其吸收平均約 7.5%，缺鐵時可提高到 21%，鐵充足時會為 2.5%。飲食成分會影響非血鐵 質的吸收，促進吸收的成分主要有維生素 C 和禽畜魚等肉，維生素 C 含 在 25-100 mg 之間與鐵吸收有正比關係，增高劑並無進一步的效。肉 包括禽、畜、魚貝等動物之肌肉蛋白質，其消化分解之小分子產物可以與鐵形 成可溶性錯合物以增加鐵的溶解而促進吸收。西式乳酸發酵之蔬菜、發酵黃 豆製品也有促進鐵吸收的效。由於飲食
7、鐵質之吸收並完全，故以鐵可用代表食物或飲食中可被人體正 常消化、吸收並供生用的鐵，這是綜合個生過程的結果，這些過程大 致上可分為三個步驟：(1)消化，(2 )小腸細胞攝入鐵(iron uptake )與血液 運輸，及( 3 )形成功能性蛋白質以執生功能。因此，測上述過程可以反 映鐵可用。二、鐵可用評估原(4, 15, 16)目前食物鐵可用的評估方法分為體外(in vitro )測法、動物實驗法與 人體實驗法三種。體外測法有體外消化透析法(in vitro digestion and dialysis )與體外消化 aco-2細胞攝鐵法(in vitro/Caco-2 cell culture
8、model)。體外消化透析法是根據 可溶性、小分子鐵錯合物才可能被人體吸收的原，採用模擬胃腸消化作用之 條件，將食物消化分解後，用透析膜分小分子含鐵成分，稱為可透析 鐵(dialyzable iron )，測其比以間接代表鐵可用，所得之結果與人體 鐵吸收顯著相關。體外消化一Caco-2細胞攝鐵法除用模擬胃腸消化作用之條件與透析膜分小分子含鐵成分之外，加上細胞模式以模擬小腸之吸收作 用，吸收之鐵可誘導細胞內鐵蛋白之生合成，者有正相關性，故以鐵蛋白 間接代表鐵可用。 Caco-2 細胞源自人大腸腺細胞瘤( colon adeno- carcinoma)，會自發性分化，並擁有許多小腸細胞的特性，包括
9、極化(polarization)的型態、形成微絨毛(microvilli)與tight junction，細胞內有儲 鐵用之鐵蛋白，並且具有與鐵吸收相關的 DMT1、 HFE 等各種蛋白質，多種促 進或抑制鐵吸收之成分可影響其攝鐵作用，與小腸之反應相似。在美國國家衛 生院(NIH ) the Office of Dietary Supplements 與 the American Society of Nutritional Sciences 的研討會中，此法被認為具有高的應用價值，所測得之結 果與人體鐵吸收顯著相關。動物實驗法採用最為普遍的是 AOAC (Association of Off
10、icial Analytical Chemists)建議之大鼠血紅素再生法(rat hemoglobin repletion bioassay)。其 原是用缺鐵貧血大鼠對食物鐵質有最大的吸收能，並且優先用於合成血 紅素，故以含鐵食物或化合物後，追蹤其血紅素濃之增加，可以反映食物 之鐵可用，可用區別同鐵源的用效。此法屬於終點(endpoint)測 法 ， 符合鐵 可 用 的定義。 國際營養性貧血 顧問小組 (International Nutritional Anemia Consultative Groups) 曾經比較 AOAC 法與人體試驗測得之鐵 可用，發現者顯著相關，可作為人體鐵可用之
11、考。動物實驗法之主要 限制是適合評估促進鐵吸收之成分，因為缺鐵貧血大鼠的鐵吸收很高，足 以掩飾其他促進因子的效應。 AOAC 法自 1974 建以並無任何修訂版本， 然而隨著動物實驗技術之進步，以及鐵吸收機制之新知，其基礎配方已 適用，修訂之配方(表一)及條件應考蕭氏之政院衛生署委託計畫研究報 告改並建我國保健食品補鐵機能評估的檢測方法 (36)。人體實驗法可以直接反映食品之鐵可用，是補鐵功能的最佳指標。雖然 鐵之吸收用可以放射性同位素鐵追蹤定，但此等方法在國內難以執。可 的方法是以缺鐵貧血者為試驗對象之血紅素增生法，提供促進鐵吸收健康食 品，使其依照食品使用明服用，定期追蹤血紅素等鐵營養相關
12、指標之增加 ，據以評估鐵可用。人體對鐵之吸收用有其恆定調控機制，健康食品可以經由改變鐵之形 式，提供促進鐵吸收之成分或去除抑制鐵吸收之成分等策以提高食品之鐵可 用。因此健康食品促進鐵吸收功效可以依產品特性採用同評估方法(表 一)。實驗結果符合下三項標準之一，即可評定為具有促進鐵吸收之功能：1. 人體實驗結果獲得顯著的促進效應2. 體外消化Caco-2細胞攝鐵實驗或大鼠血紅素再生實驗獲得顯著的促進效應3. 體外消化透析法配合體外消化一Caco-2細胞攝鐵實驗，或體外消化透析法配 合動物實驗獲得顯著的促進效應。表-、促進鐵吸收之產品策與適用之評估方法產品策適用之評估方法改變鐵之形式1. 人體試驗2
13、. 大鼠血紅素再生法3. 體外消化一Caco-2細胞攝鐵法4. 體外消化透析法+體外消化一Caco-2細胞攝鐵法5. 體外消化透析法+大鼠血紅素再生法提供促進鐵吸收之成分1. 人體試驗2. 體外消化一Caco-2細胞攝鐵法3. 體外消化透析法+ Caco-2細胞實驗去除抑制鐵吸收之成分1. 人體試驗2. 大鼠血紅素再生法3. 體外消化一Caco-2細胞攝鐵法4. 體外消化透析法+ Caco-2細胞攝鐵法5. 體外消化透析法+大鼠血紅素再生法三、評估方法與步驟(一)體外消化透析法(in vitro digestion and dialysis)：簡稱透析法(ni) 1. 儀器設備食物研磨機、pH
14、測定儀(pH meter )、控溫震盪培養箱或控溫震盪水浴槽 (shaker incubator )、原子 吸收光譜儀(atomic absorption photometer )、分光光 計( spectrophotometer)。2. 主要器材透析膜 MWCO 6,000 8,000 (Spectra/Por) ，使用之前以去子水浸泡 12 小時；有蓋高型玻璃燒杯，容 100T50 mL ；透析膜夾等。實驗用玻璃器皿均 應以酸液浸泡，經去子水沖淨，去除鐵之污染後方可使用。3. 藥品與試劑胃蛋白 酶(pepsin )： porcine，活性 800-2500 units/mg protein
15、。 胰臟酵素 (pancreatin)：porcine ，活性 4 x U. S. P. specifications。 膽汁萃取物 (bile extract)：glycine and taurine conjugates of hyodeoxycholic and other bile salts。各種酸鹼試劑與藥品必須無微礦物質污染，包括：HCl、 NaHCO3、trichloroacetic acid (TCA) 、 hydroxylamine hydrochloride 、 sodium acetate、bathophenanthroline disulfonate 、原子吸光分析用
16、鐵標準溶液 等。胃蛋白酶溶液(pepsin solution)，簡稱胃液每 100 mL 的 0.1 N HCl 溶液中含 2.5-5 g 胃蛋白酶，加入子交換 樹脂(Chelex-100) 2.5-5 g，室溫震盪反應30分鐘，心或過移除樹 脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清瓶中，儲存於 4C下，於-星 期之內使用。胰液膽鹽懸浮液( pancreatin-bile suspension) ，簡稱胰液每100 mL的0.1 M NaHCO3溶液中含0.2-0.4 g胰臟酵素及1.2- 2.5 g膽汁萃取物，加入子交換樹脂 (Chelex-100) 15 g，室溫震盪反 應 30 分鐘，心或過移除樹脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清
