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1、天津兰博实验仪器设备有限公司LabAlliace高效液相色谱系统培训教材一、液相色谱系统的基本原理 1、色谱法分类按两相的物物理状态态可分为为：气相相色谱法法(GCC)和液液相色谱谱法(LLC)。气气相色谱谱法适用用于分离离挥发性性化合物物。GCC根据固固定相不不同又可可分为气气固色谱谱法(GGSC)和气液液色谱法法(GLLC)，其其中以GGLC应应用最广广。液相相色谱法法适用于于分离低低挥发性性或非挥挥发性、热热稳定性性差的物物质。LLC同样样可分为为液固色色谱法(LSCC)和液液液色谱谱法(LLLC)。此外外还有超超临界流流体色谱谱法(SSFC)，它以以超临界界流体（界界于气体体和液体体之
2、间的的一种物物相）为为流动相相（常用用CO22），因因其扩散散系数大大，能很很快达到到平衡，故故分析时时间短，特特别适用用于手性性化合物物的拆分分。按原理分为为吸附色色谱法(AC)、分配配色谱法法(DCC)、离离子交换换色谱法法(IEEC)、排排阻色谱谱法(EEC，又又称分子子筛、凝凝胶过滤滤(GFFC)、凝凝胶渗透透色谱法法(GPPC）和和亲和色色谱法。(此外还还有电泳泳)。按操作形式式可分为为纸色谱谱法(PPC)、薄薄层色谱谱法(TTLC)、柱色色谱法。2、液相色色谱理论论发展简简况色谱法的分分离原理理是：溶溶于流动动相(mmobiile phaase)中的各各组分经经过固定定相时，由由于
3、与固固定相(staatioonarry pphasse)发发生作用用（吸附附、分配配、离子子吸引、排排阻、亲亲和）的的大小、强强弱不同同，在固固定相中中滞留时时间不同同，从而而先后从从固定相相中流出出。又称称为色层层法、层层析法。色谱法最早早是由俄俄国植物物学家茨茨维特（TTsweett）在在19006年研研究用碳碳酸钙分分离植物物色素时时发现的的，色谱谱法(CChroomattogrraphhy)因因之得名名。后来来在此基基础上发发展出纸纸色谱法法、薄层层色谱法法、气相相色谱法法、液相相色谱法法。液相色谱法法开始阶阶段是用用大直径径的玻璃璃管柱在在室温和和常压下下用液位位差输送送流动相相，称
4、为为经典液液相色谱谱法，此此方法柱柱效低、时时间长（常常有几个个小时）。高高效液相相色谱法法(Hiigh perrforrmannce Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HPPLC)是在经经典液相相色谱法法的基础础上，于于60年年代后期期引入了了气相色色谱理论论而迅速速发展起起来的。它它与经典典液相色色谱法的的区别是是填料颗颗粒小而而均匀，小小颗粒具具有高柱柱效，但但会引起起高阻力力，需用用高压输输送流动动相，故故又称高高压液相相色谱法法(Hiigh Preessuure Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HPPLC)。又因因分析速速度快而而称为
5、高高速液相相色谱法法(Hiigh Speeed Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HSSLP)。也称称现代液液相色谱谱。3、HPLLC的特特点和优优点HPLC有有以下特特点：高压压力力可达11503000kg/ccm2。色谱谱柱每米米降压为为75 kg/ccm2以上。高速流速速为0.11100.00 mll/miin。高效可达达50000塔板板每米。在在一根柱柱中同时时分离成成份可达达1000种。高灵敏度紫外检检测器灵灵敏度可可达0.01nng。同同时消耗耗样品少少。HPLC与与经典液液相色谱谱相比有有以下优优点：速度快通通常分析析一个样样品在115330 mmin，有
6、有些样品品甚至在在5 mmin内内即可完完成。分辨率高可选择择固定相相和流动动相以达达到最佳佳分离效效果。灵敏度高紫外检检测器可可达0.01nng，荧荧光和电电化学检检测器可可达0.1pgg。柱子可反复复使用用一根根色谱柱柱可分离离不同的的化合物物。样品量少，容容易回收收样品品经过色色谱柱后后不被破破坏，可可以收集集单一组组分或做做制备。4、高效液液相色谱谱分离原原理高效液相色色谱法按按分离机机制的不不同分为为液固吸吸附色谱谱法、液液液分配配色谱法法（正相相与反相相）、离离子交换换色谱法法、离子子对色谱谱法及分分子排阻阻色谱法法。a液固色色谱法使用固固体吸附附剂，被被分离组组分在色色谱柱上上分
7、离原原理是根根据固定定相对组组分吸附附力大小小不同而而分离。分分离过程程是一个个吸附解吸附附的平衡衡过程。常常用的吸吸附剂为为硅胶或或氧化铝铝，粒度度5110mm。适用用于分离离分子量量200010000的的组分，大大多数用用于非离离子型化化合物，离离子型化化合物易易产生拖拖尾。常常用于分分离同分分异构体体。b液液色色谱法使用将将特定的的液态物物质涂于于担体表表面，或或化学键键合于担担体表面面而形成成的固定定相，分分离原理理是根据据被分离离的组分分在流动动相和固固定相中中溶解度度不同而而分离。分分离过程程是一个个分配平平衡过程程。涂布式固定定相应具具有良好好的惰性性；流动动相必须须预先用用固定
8、相相饱和，以以减少固固定相从从担体表表面流失失；温度度的变化化和不同同批号流流动相的的区别常常引起柱柱子的变变化；另另外在流流动相中中存在的的固定相相也使样样品的分分离和收收集复杂杂化。由由于涂布布式固定定相很难难避免固固定液流流失，现现在已很很少采用用。现在在多采用用的是化化学键合合固定相相，如CC18、CC8、氨基基柱、氰氰基柱和和苯基柱柱。液液色谱法法按固定定相和流流动相的的极性不不同可分分为正相相色谱法法(NPPC)和和反相色色谱法(RPCC)。正相色谱法法采用用极性固固定相(如聚乙乙二醇、氨氨基与腈腈基键合合相)；流动相相为相对对非极性性的疏水水性溶剂剂(烷烃烃类如正正已烷、环环已烷
9、），常常加入乙乙醇、异异丙醇、四四氢呋喃喃、三氯氯甲烷等等以调节节组分的的保留时时间。常常用于分分离中等等极性和和极性较较强的化化合物(如酚类类、胺类类、羰基基类及氨氨基酸类类等）。反相色谱法法一般般用非极极性固定定相（如如C188、C8）；流流动相为为水或缓缓冲液，常常加入甲甲醇、乙乙腈、异异丙醇、丙丙酮、四四氢呋喃喃等与水水互溶的的有机溶溶剂以调调节保留留时间。适适用于分分离非极极性和极极性较弱弱的化合合物。RRPC在在现代液液相色谱谱中应用用最为广广泛，据据统计，它它占整个个HPLLC应用用的800%左右右。随着柱填料料的快速速发展，反反相色谱谱法的应应用范围围逐渐扩扩大，现现已应用用于
10、某些些无机样样品或易易解离样样品的分分析。为为控制样样品在分分析过程程的解离离，常用用缓冲液液控制流流动相的的pH值值。但需需要注意意的是，CC18和CC8使用的的pH值值通常为为2.557.5（228），太太高的ppH值会会使硅胶胶溶解，太太低的ppH值会会使键合合的烷基基脱落。有有报告新新商品柱柱可在ppH 11.510范范围操作作。正相色谱法法与反相相色谱法法比较表表正相色谱法法 反相相色谱法法固定相极性性高中中 中中低流动相极性性低中中 中中高组分洗脱次次序极性性小先洗洗出 极性大大先洗出出从上表可看看出，当当极性为为中等时时正相色色谱法与与反相色色谱法没没有明显显的界线线（如氨氨基键
11、合合固定相相）。c离子交交换色谱谱法固固定相是是离子交交换树脂脂，常用用苯乙烯烯与二乙乙烯交联联形成的的聚合物物骨架，在在表面未未端芳环环上接上上羧基、磺磺酸基（称称阳离子子交换树树脂）或或季氨基基（阴离离子交换换树脂）。被被分离组组分在色色谱柱上上分离原原理是树树脂上可可电离离离子与流流动相中中具有相相同电荷荷的离子子及被测测组分的的离子进进行可逆逆交换，根根据各离离子与离离子交换换基团具具有不同同的电荷荷吸引力力而分离离。缓冲液常用用作离子子交换色色谱的流流动相。被被分离组组分在离离子交换换柱中的的保留时时间除跟跟组分离离子与树树脂上的的离子交交换基团团作用强强弱有关关外，它它还受流流动相
12、的的pH值值和离子子强度影影响。ppH值可可改变化化合物的的解离程程度，进进而影响响其与固固定相的的作用。流流动相的的盐浓度度大，则则离子强强度高，不不利于样样品的解解离，导导致样品品较快流流出。离子交换色色谱法主主要用于于分析有有机酸、氨氨基酸、多多肽及核核酸。d离子对对色谱法法又称称偶离子子色谱法法，是液液液色谱谱法的分分支。它它是根据据被测组组分离子子与离子子对试剂剂离子形形成中性性的离子子对化合合物后，在在非极性性固定相相中溶解解度增大大，从而而使其分分离效果果改善。主主要用于于分析离离子强度度大的酸酸碱物质质。分析碱性物物质常用用的离子子对试剂剂为烷基基磺酸盐盐，如戊戊烷磺酸酸钠、辛
13、辛烷磺酸酸钠等。另另外高氯氯酸、三三氟乙酸酸也可与与多种碱碱性样品品形成很很强的离离子对。分析酸性物物质常用用四丁基基季铵盐盐，如四四丁基溴溴化铵、四四丁基铵铵磷酸盐盐。离子对色谱谱法常用用ODSS柱（即即C188），流流动相为为甲醇-水或乙乙腈-水水，水中中加入33100 mool/LL的离子子对试剂剂，在一一定的ppH值范范围内进进行分离离。被测测组分保保时间与与离子对对性质、浓浓度、流流动相组组成及其其pH值值、离子子强度有有关。e排阻色色谱法固定相相是有一一定孔径径的多孔孔性填料料，流动动相是可可以溶解解样品的的溶剂。小小分子量量的化合合物可以以进入孔孔中，滞滞留时间间长；大大分子量量
14、的化合合物不能能进入孔孔中，直直接随流流动相流流出。它它利用分分子筛对对分子量量大小不不同的各各组分排排阻能力力的差异异而完成成分离。常常用于分分离高分分子化合合物，如如组织提提取物、多多肽、蛋蛋白质、核核酸等。5、固定相相和流动动相在色谱分析析中，如如何选择择最佳的的色谱条条件以实实现最理理想分离离，是色色谱工作作者的重重要工作作，也是是用计算算机实现现HPLLC分析析方法建建立和优优化的任任务之一一。本节节着重讨讨论填料料基质、化化学键合合固定相相和流动动相的性性质及其其选择。（1）基质质（担体体）HPLC填填料可以以是陶瓷瓷性质的的无机物物基质，也也可以是是有机聚聚合物基基质。无无机物基
15、基质主要要是硅胶胶和氧化化铝。无无机物基基质刚性性大，在在溶剂中中不容易易膨胀。有有机聚合合物基质质主要有有交联苯苯乙烯-二乙烯烯苯、聚聚甲基丙丙烯酸酯酯。有机机聚合物物基质刚刚性小、易易压缩，溶溶剂或溶溶质容易易渗入有有机基质质中，导导致填料料颗粒膨膨胀，结结果减少少传质，最最终使柱柱效降低低。A基质的种种类1）硅胶硅胶是HPPLC填填料中最最普遍的的基质。除除具有高高强度外外，还提提供一个个表面，可可以通过过成熟的的硅烷化化技术键键合上各各种配基基，制成成反相、离离子交换换、疏水水作用、亲亲水作用用或分子子排阻色色谱用填填料。硅硅胶基质质填料适适用于广广泛的极极性和非非极性溶溶剂。缺缺点是在在碱性水水溶性流流动相中中不稳定定。通常常，硅胶胶基质的的填料推推荐的常常规分析析pH范范围为228。硅胶的主要要性能参参数有：平均粒度度及其分分布。平均孔径径及其分分布。与与比表面面积成反反比。比表面积积。在液液固吸附附色谱法法中，硅硅胶的比比表面积积越大，溶溶质的kk值越大大。含碳量及及表面覆覆盖度（率率）。在在反相色色谱法中中，含碳碳量越大大，溶质质的k值值越大。含水量及及表面活活性。在在液固
