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1、湖北生物科技职业学院学生毕业论文湖北生物科技职业学院学生毕业论文论文题目：应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库 系别： 生物工程系 专业：生物技术及应用 年级：0510 姓名：宁晓微 学号：0501011018 指导老师： 艾炎军 2007年11月18日14摘 要水蛭索是水蛭中抗凝血蛋白质的一种，它对凝血酶有强烈抑制作用：水蛭索的三维构象与水蛭中作用于血小板糖蛋白b a的拈抗剂decorsin十分相似，而该拮抗剂是以RGD保守序列作为识别序列的。本文试图通过水蛭素定向进化获得既抑制凝血酶又抑制血小板凝集的双功能抗凝剂。因此，本文运用DNA改组技术，在重组反应中掺入含RGD基序的化学合成的寡聚核
2、苷酸，得到水蛭素各种变异体基因，然后将此突变体基因片段插入噬菌质粒pCANTAB 5 G8，转化大肠杆菌，建立水蛭索突变体噬菌体表面展示库。建库后，分别用凝血酶和血小板对这个库进行亲和淘选，初步结果显示，在实验定向进化中可看出选出的突变体抗凝血酶活性与血小板结合能力都随着淘选而提高。并且当一种选择压力消失时，在该压力下选择出的某性状也会随之减弱。因此，在适宜选择条件下有希望从突变体库中选择出既抑制凝血酶又与血小板有结台能力的双功能水蛭素突变基因。进一步的淘选工作和DNA测序鉴定工作正在进行中。、关键词：水蛭素；DNA改组；亲和淘选。目 录摘 要1目 录2引 言31材料和方法51.1材料51.1
3、.1试剂和菌种51.1.2器材61.2方法61.2.1改组联合随机片段的插入61.2.2 pCANTAB 5V G8HInd,BamHI大片段与水蛭素基因的连接81.2.3 构建水蛭素突变体库9结 论12致 谢15参 考 文 献16引 言 水蛭是我国的传统中药，早在1800年前的神农本草经中就有记载。中医认为水蛭有破血、逐瘀、通经等功效。1884年Havcraft发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质。1955年 Markwardt从水蛭头部分离纯化出一种蛋白质,命名为水蛭素(Hirudin)，并于1970年确定为凝血酶的特异性抑制剂，由此开始了对吸血水蛭中抗凝血物质的多方面研究。一系列的动物
4、实验和临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血，抗血栓形成，阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应，抑制凝血酶诱导的多种细胞增殖，水蛭素可用于治疗各种血栓性疾病，尤其是治疗静脉血栓，弥漫型血管内凝血，促进手术后伤口愈合和预防动脉血栓等。研究还表明，水蛭素能阻止许多肿瘤细胞的转移，在肿瘤治疗中也能发挥一定的作用。水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种具有强烈抗凝血作用的小分子蛋白质。水蛭素通常是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为7000道尔顿左右。分子中不含精氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。水蛭素分子N端区域有三对二硫键(C6C14，C16C28，C22一C39)，使其形成紧密的空间构象。水蛭素的C端是一
5、酸性区，其最后九个氨基酸残基中有五个是酸性氨基酸，并有一个硫酸酯化的酪氨酸(第63位)。水蛭素是凝血酶的天然抑制剂，它和凝血酶以l：l的比例形成紧密的非共价结合的稳定复合物，解离常数为10-11molL10-14 molL。水蛭素-凝血酶复合物的三维结构显示：水蛭素的 N端结合域覆盖在凝血酶的活性位点，C端与带正电的血纤维蛋白原结合位点呈多点结合，其中 N端三个氨基酸与凝血酶活性位点的接触至关重要。许多研究表明，水蛭素是一多位点作用的抑制剂，其N端和C端结构域分别都有抗凝血活性，二者通过接头区(4954)协同作用，从而表现出对凝血酶高度特异的抑制作用。 水蛭素是水蛭中抗凝血蛋白质与多肽的一种，
6、这类蛋白具有相似的基序，因而选择水蛭素作为原型开展实验定向进化的研究，应用分子生物学的手段实现蛋白质性质的改造。自然界中，生物大分子的进化是一个突变和选择的过程，经历漫长的岁月，每一个分子都包含复杂的结构和功能信息，生物大分子之间相互作用形成一个相互制约、共同进化的平衡体系，对生物大分子结构和功能关系的了解是认识生物分子进化的基础.蛋白质工程在已知蛋白质的某些结构和功能基础上，利用定位诱变进行氨基酸残基的置换,试图改变蛋白质的某些特性，这方面的工作对深入了解结构功能关系起了很大作用，同时也获得了许多具有新特性的蛋白质,但由于对蛋白质结构功能了解的欠缺,很多改造工作没有达到预期目的。随机诱变和特
7、异选择在某种程度上克服了上述困难，尤其是噬菌体展示技术与 DNA改组技术的建立，使蛋白质改性方面的工作有了较大的突破。在某种意义上，随机诱变和选择过程模拟了自然界进化的历程。因此，我们可以在实验室条件下，通过随机诱变并施加特定的选择压力来筛选特定的生物大分子，实现生物大分子的体外快速进化，并且有可能创造新的基因、新的蛋白质，乃至新的物种。 目前，主要有三种诱变方法应用于实验定向进化：错误倾向PCR(error-prone PCR)是在PCR中改变反应条件,采用无校正功能的Taq DNA聚合酶，从而提高PCR反应的错误率的一种随机诱变的方法.它比较简便，易于操作，但对于大于0.5Kb的大片段很难
8、运作，因此无法用来研究有机体的全长基因组。盒式诱变是在基因的某个区域插入变异密码子造成一个区域的完全随机编码，该方法主要用于研究蛋白质局部的结构和功能.DNA改组一定程度上弥补了以上两种方法的缺陷，是现阶段比较普遍的研究实验定向进化的一种强有力的手段。它能提高定向进化的材料的丰度,用于人工选择和自然选择，从而将单个基因中的有利突变积累起来，并通过重组产生多样性,在同源序列区产生交叉，促进了基因组的复杂化：1994年Stemmer PC首先应用此方法实现了-半乳糖苷酶向 -岩藻糖苷酶的性质转化，发现它在提高突变率上优于前述的另两种方法。Singte gene _Random Fragmentat
9、ion Pool of random - - - -DNA fragments - - - - - - - - - - - - Reassembly PCR Mutagenic & Recomomogenic 图1 DNA改组近程图示 DNA改组的实现需经三个步骤：第一步是将某DNA分子的变异群(DNA variants)用DNA处理使之随机片段化(random fragmentation)，第二步是将这些随机片段进行自身引物PCR反应(selfpriming PCR)重新得到全长基因。由于同源性，各个片段能互为引物，当某一个DNA分子的片段作为另一个DNA分子的片段的引物时，则发生了模板交错
10、。这样，以此为模板的重组合 PCR反应(reassembly PCR)就能扩增出我们需要的具有一定突变的基因片段了(见图l)。 近几年来，DNA改组技术得到了广泛的应用和发展，并体现出广阔的前景，主要有以下几个方面：(1)将一族高同源的基因片段经DNA酶消化以后，回收小片段再重组回原来的大小，并得到有利变异。这是改组技术运用得最广泛的一个方面，用于积累有利变异、构建突变体厍、实现快速定向进化等。(2)分子量较大的质粒经重排得到两个大小不同的标记片段的完全重组，这两个标记片段原来在不同的基因上。(3)化学合成的、与消化片段有35个同源的寡聚核苷酸能整合到重组基因中。(4)DNA改组技术运用于回交
11、等遗传模拟实验中。(5)用于研究抗体等同源基因的结构和功能关系。在实验设计中，由于曾有人在吸血水蛭Macrobdella deeora中分离到血小板糖蛋白b a的拮抗剂，其三维构象与水蛭素很相似，其C端RGD序列与GPb一a相识别而介导它们之间的相互作用，从而抑制了血纤维蛋白原介导的血小板聚集，我们希望通过在水蛭素基因中引入RGD基序使水蛭素具有与血小板结合的能力。具体方法是，应用DNA改组技术使水蛭素野生型基因与随机物同源重组，借助噬菌体展示构建变异体重组噬菌体库，通过凝血酶和血小板的亲和淘选得到改进性能的变异体。目前已构建了变异体库，选择工作正在进行中。需要说明的是，这项改造工作已经有人在
12、从事并且取得一定的成效，而本实验除了希望得到具有有利变异的突变体以外。还希望能够探索一种有效的实验定向进化方法，具体言之就是运用DNA改组技术来建立突变体库，为实现水蛭素的快速定向进化提供丰富的材料。另外，水蛭素N端的三个氨基酸与凝血酶活性位点的接触至关重要。据文献报导，在水蛭素基因中引入 RGD基序时，一般是在突环部位进行定位诱变或盒式诱变。本实验的另一个任务即是探索RGD肽结合在水蛭素别的部位时是否能产生相同或相似的功效，而且不需要在RGD基序的两端引入限制性酶切位点。 1材料和方法 流程 水蛭素野生型基因 PCR方法扩增 DNasel消化 回收10-50bp片段自身引物PCR反应得到全长基因 提取pCANTAB 5V GG8-Hir质粒掺人化学合成的寡聚核苷酸PN21 BamH,Hin
