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1、激光扫描共焦显微镜技术的应用Confocal 主要应用特点：形态学观察与检测：亚细胞器定位，如最简单的核定位二维定位、定量三维定位、图像重组生理学测量：动态测量：实时检测静态测量：活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化测量（Mg2+、Zn+、Na+、K+）（动态/静态） 自由基的检测（动态/静态）药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量蛋白质的转位（动态/静态）激光扫描共焦显微镜技术的应用活细胞内H+浓度（pH值）的测量（动态/静态）合线粒体膜电位的测量（动态/静态）光谱测量蛋白质功能检测荧光漂白恢复（FRAP）的测量和FLIP荧光能量共振转移（FRET）的测量（动态/静态）光活化和光转化检
2、测其他应用激光扫描共焦显微镜技术的应用一、形态学观察与检测免疫荧光标记（单标、双标或三 标）如：细胞膜受体、某种蛋白或酶的分布与表达，细胞骨架的分布、两种或三种蛋白的共存与 共定位、蛋白与亚细胞器的共定位、核转录因子转位、细胞的增值、分化细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI末端原位杂交-fitc + PI8-氧脱氧鸟苷激光扫描共焦显微镜 技术的应用 荧光原位杂交： 染色体基因定位 单细胞凝胶电泳 gfp融合蛋白的表达 蛋白的核转位荧光标记1）细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免疫荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白 tublin （ 抗
3、 tublin 抗体+荧光探针）TubulinTrackef： Oregon Green 488 Taxol bis-acetate：紫衫醇 肌动蛋白actin （ Palloidine+荧光探针Trite） 2）细胞膜表面受体与胞内受体（活细胞） 配体+荧光探针如:nAchR、mAchR、多巴胺受体（D1,D2）标记Gm1:霍乱毒素受体：霍乱毒素+FITC 标记 Ip3 受体： HeparinFITCTfR受体：转铁蛋白+TRITC荧光染料的重要特性光谱特性:激发光谱和发射光谱光量子产率：特定条件下为常数，每个染料分子的荧光强度与光量子产率成正比。摩尔吸光系数：代表染料对激发光的吸收能力光稳
4、定性，光漂白性ph稳定性 特异性和毒性定位、定量研究中常用荧光探针GreenFITC 494/518RedTRITCFar-Red544/572Cy5650/690（异硫氰基荧光素）（四甲基异硫氰基罗丹明）Alexa Fluor 488488/530PE565/578Cy5.5532（ 藻红蛋白 ）Cy7633Texas Red595/615350（德州红）405Cy3 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618Alexa Fluor 染料 Alexa Fluor 染料 是一系列高亮度的卓越染料，他们的优点如下亮度
5、一 Alexa Fluor比相似发射光谱的染料的荧光更强。光稳定性一 Alexa Fluor比其他的荧光染料的光稳定性好，可更长时间采集图像颜色可选择性好一Alexa Fluor提供从蓝色到红色不同的颜色可选择。强度不受PH值影响一Alexa Fluor在宽的PH值范围内有强荧光水溶性好一 Alexa Fluor 染料的水溶性好，在细胞体系中可不使用有机溶剂，在储存中抗沉淀 Alexa Fluor 染料BODIPY 类荧光染料对酸碱不敏感。荧光量子产率一般都比较高，有的甚至在水中的荧光量子产率可以接近 1 0。 具有相对较好的光稳定性。荧光光谱半峰宽较窄，作为荧光标识时有很好的灵敏度。BODI
6、PY染料的摩尔吸光系数8很大，通常大于80 000 L/( mobcm),吸光效率比较高。BODIPY FL 503/512BODIPY TMR 543/569BODIPY TR 592/618标记细胞器荧光探针1)线粒体 MitochondriaRodamin 123505/534 ，可染活细胞，阳离子, 可检测线粒体膜电位。在多数正常细胞中停留时间长，在肿瘤细胞 中停留时间短。因此，可用来研究肿瘤细胞的 多药抗药性。JC1 线粒体膜电位低时为单体， 490/527 发绿光线粒体膜电位高时为多聚体， 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最 佳探针。MitoTrac
7、ker probes 的光谱特性标记细胞器荧光探针Mitotracker 这类染料可被动扩散入胞内，染活细胞线粒体，在细胞固定和通透后，染料仍停 留在细胞内，保留活细胞时的原样。可与GFP、免疫荧光等进行多重标记。 MitoFluor Green Probe 是 MitoTracker Green FM 的衍生物，可着染活细胞中的线粒体， 固定后荧光不能保持。比罗丹明123的荧光强且光稳定性好。红色的MitoFluor荧光探针包括 MitoFluor Red 589 、 MitoFluor Red 594 MitoFluor Red 589 探针在线粒体聚集，且不受线 粒体膜电位的影响。Mit
8、oFluor Red 594 probe是对线粒体膜电位敏感的染料。MitoSOX Red 线粒体过氧化的标记物MitoSOX Red线粒体ROS探针 是一种高选择性的活细胞线粒体过氧化物检测的荧光染料。 它可以通透活细胞并靶向线粒体。一旦在线粒体中被过氧化物氧化，发出明亮的红色荧光并与 核酸结合。 （激发/发射峰为510/580 nm ）MitoSOX Red 探针易于被过氧化物氧化，但不能被 其他ROS或氮自由基（RNS）产生系统氧化，并且氧化过程被超氧化物歧化酶所阻断。这种 染料使研究者能够在活细胞的线粒体中直接测量其产生的过氧化物而不必分离线粒体。 标记细胞器荧光探针2）溶酶体 Lys
9、osome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性AO :LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞，固定和通透后，仍保持原样停留在细胞内。LysoTracker Red DND-99 用于溶酶体损伤，细胞凋亡和受 体及通道蛋白的亚细胞地位的研究Lysosensor 是一种嗜酸性的染料，其荧光强度随溶酶体酸性 的提高而升高。用于测定溶酶体的 PH 值标记细胞器荧光探针3）高尔基体 Golgi apparatusNBD C6-ceramide 466/536, 可染活或死细胞Bodipy FL C5-ceramide、Bodipy
10、TR C5-ceramideBodipy FL C5-神经酰胺的荧光特性有浓度依赖性。高浓度时，发射峰可从515nm变为 620nm。多用于高尔基体染色。Bodipy FL C5神经酰胺特异结合于高尔基体后，神经酰胺代谢 为神经鞘磷脂，继而与其他膜 （主要是核膜和质膜） 结合。其他膜发绿色荧光，而高尔基体发 红色荧光。Bodipy FL C5-神经酰胺 Ex: Em 一 503nm: 515nm标记细胞器荧光探针4) 内质网 Endoplasmic ReticulumDiOC6(3) 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,DiOC5(3)较低浓度标记线粒体ER blue white
11、 360nm/430nm-640nmER-Tracker Green and Red Dyes 540/587nm5) 自噬体 autophagosomeMDC 360nm/430nm 以上激光扫描共焦显微镜技术的应用6）细胞核PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死细胞 碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞Hochest 33342Hochest 33258DAPI352/461 DNA A-T352/461 DNA A-T358/461 DNA活细胞活细胞A-T 半通透细胞Chromomycin A3450
12、/470 DNA G-CAO500/526 DNA活细胞560/650 RNATOTO-1514/533 DNA死细胞SYTO11162024488/ 520活细胞SYTO11162024521/ 556活细胞SYTO 17621/634活细胞荧光蛋白示踪 绿色荧光蛋白 不同种类的荧光蛋白 蓝色荧光蛋白BFP 青色荧光蛋白CFP 绿色荧光蛋白 GFP 黄色荧光蛋白 YFP 红色 DsRed荧光蛋白主要应用口对活细胞中的某种蛋白进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时 空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶 C 的膜转位等。口 GF
13、P 基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程口 GFP 基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔 基体、线粒体等细胞器的结构可用于观察分子的运动（FRAP）蛋白之间的相互作用（FRET）在选择钙探针时应考虑的因素探针的形式 （盐, AM ester 甲基乙酸酯或者葡聚糖结合物）探针的形式影响细胞负载的方式和 探针在细胞内的分布和存留。盐和葡聚糖形式的探针用显微注射，微粒轰击或者电穿孔等方法 进入细胞，而甲基乙酸酯有细胞膜通透性，可被动扩散进入细胞，在细胞内由酯酶裂解。测定方式：取决于离子浓度的定量还是定性的测定。探针在与离子
14、结合后出现光谱转移的可 用比值法测定钙离子的浓度扩散系数（Kd）,与所测定区域的钙浓度范围相当。探针的可测量的离子浓度范围在0.1 X Kd到10 X Kd之间。钙探针的Kd值受许多因素的影响，包括PH,温度，离子强度，蛋 白质结合和是否存在镁离子和其它离子。测量细胞内钙变化的探针荧光探针激发波长发射波长KdFLuo3-AMFluo4Calcium Green-1Calcium Green-2506nm506nm507nm507nm525nm525nm530nm535nm390nM345nM190nM550nMFura red420/480nm 637nm140nMOregon Green 488 494nmCalcium Crimso583nmIndo-1356nmFura-2520nm602nm405/458nm20,000nM328nM230nM340/380 476nm 145nM检测线粒体钙的探针Rhod-2，Rhod-5N，Rhod-FF，X-rhod-1， X-rhod-5F，X-rhod-FF 。是一系列细胞通透的 阳离子钙探针，在某些细胞中局限分布于线粒体，主要是通过电位驱动的膜摄取形成的。线粒 体钙离子摄取能力强，因此需要低亲和性的钙探针来精确的测量其钙浓度。pH 值的
