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1、HPCE统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一项液相分离技术。是以电泳强有力的分离机理与色谱的仪器及自动化相结合的产物，可看作是电泳的一种仪器化方式。是一种迅速发展中的新的分离分析技。HPCE特点:1.电泳是在细径弹性石英毛细管中进行；2.高电压（1030KV）加在毛细管两端以产生高电场强度；3.毛细管的高电阻限制了电流的产生和管内发热，从而抑制了热扩散的不利影响；4.柱效率高,分析时间短;5.检测在毛细管上进行（没有外部检测池），不存在检测池内的谱带展宽问题;6.所需样品体积小（为0 nl)；7.多种分离模式能改变选择性，拓宽了电
2、泳的应用范围；8.分离在水相介质中进行；9.方法开发简便；10.仪器自动化程度高，克服了板状凝胶电泳分析时间长、效率低以及检测自动化比较困难等缺点。电泳的基本原理：离子的迁移速度可用下式表示:淌度（Mobility）是指在单位时间间隔内和单位电场强度下溶质移动的距离。电渗流(Electroosmotic Flow, EOF)是指毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，大小可用速度或淌度来表示：EOF的特点：1.毛细管内的电渗流具有平面流型，呈近似扁平型的“塞式流”，使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。2.一般情况下（pH4），毛细管内壁表面带负电荷，EOF的方向是由正极到负极。3.EOF
3、的淌度比离子淌度大一个数量级，它可以使几乎所有物种，不论其电荷性质如何，向同一方向运动。因此EOF是HPCE中推动流体前进的驱动力，粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子的泳动方向和电渗流一致，迁移速度最快；中性粒子的迁移速度与电渗流速度相等；负离子的泳动方向和电渗流相反，但电渗流速度电泳流速度，故其迁移方向与EOF一致，迁移速度最慢。HPCE与LC中流体的不同流型:EOF的平面流型引起流动的推动力沿毛细管均匀分布,不会在毛细管内形成压力差,所以流速到处接近相同,对谱带展宽没有贡献。LC的抛物线流型由外部驱动泵推动流体通过色谱柱，因管壁处存在剪切力产生抛物线流
4、型，对谱带展宽有显著贡献。影响EOF的因素变量结 果说 明电场强度电渗流呈比例变化场强降低可能引起分离效率和分离度下降场强增加可能引起焦耳热缓冲液pH低pH,EOF降低高pH,EOF增加改变EOF最方便有用的方法可能改变溶质的电荷或结构离子强度或缓冲溶液浓度增加离子强度, Zeta电位下降, EOF下降高离子强度产生大电流和引起焦耳热低离子强度使样品吸附成问题如果与样品电导不同,将引起峰畸变降低离子强度将限制样品堆积效果温度改变粘度,温度每改变一度,变化2-3% 由于仪器控温,一般改变温度是有用的方法有机改性剂改变Zeta电位和粘度,EOF下降变化复杂,其效果通过实验确定可能调节选择性表面活性
5、剂通过疏水和/或离子相互作用吸附于毛细管表面 阴离子表面活性剂可以增加EOF阳离子表面活性剂可降低EOF或使反向大大改变选择性中性亲水高聚物通过蔬水相互作用EOF吸附于毛细管表面 通过覆盖表面电荷增加粘度降低共价键合化学键合于毛细管壁多种可能的改性(亲水的或带电的)稳定性常常有问题分析参数及影响因素：1.迁移时间t：溶质迁移至检测点所用的时间2.分离效率：在HPCE中,使用高电场可以大大提高柱效。引起谱带展宽的主要因素：1.纵向扩散：在进样塞较小,没有溶质-管壁相互作用等理想条件下，可将沿毛细管的纵向扩散视为HPCE中对样品区带展宽有贡献的唯一因素。2.焦耳热因电流通过而产生的热称为焦耳热，导
6、致温度梯度的产生,即毛细管中心温度高于管壁温度；引起毛细管内缓冲溶液的粘度变化从而导致区带变形。可采用降低电场强度减小毛细管内径降低缓冲溶液浓度或离子强度主动控温等方法控制温度梯度。毛细管壁温度和中心温度的温差内半径壁温度,K温差,K25299.00.5350301.21.3975304.23.14100307.75.58125311.68.723.样品塞长度：在HPCE中,减小进样时样品塞的长度非常重要，当其长度超过因扩散造成的区带展宽时,分离效率和分离度将受到损失。实际操作中,应控制进样长度在毛细管总长度的12%。进样长度与扩散系数对分离效率的影响进样长度( mm )N(D= 105cm2
7、/s)N(D =106cm2/s )1238,0001,400,0002164,000385,0001081,000112,0004.溶质与管壁的相互作用：对HPCE极其有害，在不同相互作用程度下,可能会出现拖尾峰，甚至会发生对溶质的完全吸附。对多肽及蛋白质分子而言，因其具有较多的电荷和疏水基团，这种吸附作用特别严重。增加缓冲溶液浓度、提高离子强度、调节pH、对毛细管内壁进行涂层处理等可减小溶质与管壁的相互作用。样品组分的分离度R：实际工作中，可按谱图直接计算，式中tm为迁移时间，W分别代表两个组分峰底宽度。 HPCE中促进分离的关键因素：HPCE中，主要是以其效率而不是以其选择性来促进分离，
8、这与主要靠选择性促进分离的色谱过程不同。HPCE中，由于样品区带窄，色谱峰非常尖锐，溶质间微小的淌度差（ 0.05% ）往往足以实现完全分离。HPCE的分离模式方 式英文名称分离依据毛细管区带电泳Capillary Zone ElectrophoresisCZE自由溶液的淌度（毛细管自由电泳）胶束电动毛细管色谱Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MEKC or MECC与胶束间的疏水性/离子性相互作用毛细管凝胶电泳Capillary Gel Electrophoresis, CGE分子大小和电荷毛细管等电聚焦Capillary I
9、soelectric Focusing, CIEF等电点毛细管等速度泳Capillary Isotachorphoresis,CITP移动界面毛细管电色谱Capillary Electrochromatography, CEC样品与固定相间的相互作用亲和毛细管电泳Capillary Affinity Electrophoresis, CAE与配基的亲和力毛细管区带电泳（CZE）：1.操作简单、多样化，是目前应用最广的一种方式。2.溶质的区带以不同的速率进行迁移而被分离。由于EOF的存在，正、负离子都可以用CZE来分离，中性溶质本身在电场中不移动，随EOF一起流出毛细管。胶束电动毛细管色谱（ME
10、KC或MECC）：1.是唯一的既能分离中性溶质又能分离带电组分的电泳技术。2.需要在操作缓冲溶液中加入大于临界浓度的表面活性剂。单个的表面活性剂分子聚集而形成胶束，胶束沿着与EOF相同或相反的方向迁移。当胶束的迁移方向与EOF相反时，由于一般情况下胶束的淌度小于EOF，因此其实际运动方向与EOF一致。3.MEKC的分离机理是基于胶束与被分离组分分子间的相互作用。溶质在水相和胶束相（准固定相，pseudostationary phase）之间分配，粒子因其本身疏水性不同，在两相中的分配行为有差异，疏水性强的和胶束结合牢，流出时间就长，最终按粒子疏水性的不同而得以分离。在MEKC中很容易控制选择性
11、。使用不同的表面活性剂以形成具有不同物理性质（如大小、电荷、几何形状等）的胶束就能使选择性发生显著变化。（HPLC中改变固定相）。表面活性剂可以是阳离子型的、阴离子型的、非离子型的、两性离子型的或者是几种类型的混合使用。在确定了表面活性剂之后，还可以通过改变缓冲溶液浓度、pH、温度;或使用添加剂，如尿素、金属离子或手性选择剂等方法。MEKC使用的表面活性剂表面活性剂CMC(mM)分子聚集数AnionicSDS8.262CationicDTAB1450CTAB1.378Non lonicOctylglucosiden-Dodecyl-D-maltoside0.16Triton X-1000.24
12、140ZwitterionicCHAPS810CHAPSO811Bile saltCholic acid142-4Deoxycholic acid54-10Taurocholic acid10-154毛细管凝胶（CGE）：1.是将传统的板式凝胶电泳的凝胶移到毛细管中作支持物而发展起来的一种毛细管电泳。2.主要用于分离生物大分子，如蛋白质、核酸等。这类大分子，其质荷比与分子大小无关，以DNA为例，在自由溶液中不能得到分离。而在凝胶介质中，大分子溶质基于分子尺寸而得到分离。 3.CGE能达到CE中的最高柱效。凝胶粘度大，能减少溶质的扩散；可施加比板式电泳高10100倍的场强而不引起焦耳热效应；毛细
13、管的柱上检测等因素。CGE中使用的聚合物基体聚 合 物浓 度应 用交联聚合物 :双-聚丙烯酰胺2-6 % T, 3-6 % C*寡聚核苷酸分析*DNA序列测定*蛋白质分析线性聚合物 :聚丙烯酰胺纤维素,糊精等 0.1-6 %6-15 %*限制内切片段*寡聚核苷酸,DNA测序*蛋白质分析琼脂凝胶0.05-1.2 %*限制内切片段*蛋白质HPCE的仪器装置：1.进样：进样的区带长度是比进样体积更重要的参数。样品超载会引起区带变宽、峰形畸变。一般，样品区带的长度应小于毛细管总长度的12%。常用的定量进样方式：流体力学进样；电动进样Electrokinetic InjectionCapillary a
14、nd electrode are placed into the sample.Voltage is applied.“-” charged DNA enters the capillary as it migrates toward the “+” electrode at the other end of the capillary.2.毛细管材料的理想特性包括：化学和电学惰性 紫外-可见光透光性 柔韧性、高强度和低成本带有聚酰亚胺保护层的熔融石英毛细管是目前的首选材料。聚四氟乙烯毛细管的缺点是内径不均匀，散热性较差。毛细管温度对操作的重现性很重要,要求温度稳定在设定温度的0.1范围。常用高速气流、液体恒温两种恒温办法。3.高压电源：要求：能提供30KV的直流电压和200300A的电流；输出电压稳定在0.1%。保证迁移时间的高重现性；能切换极性；具有恒压、恒流、恒功率方式；在分析过程中能够产生电压、电流或功率的梯度（也称为场强程序）。4.检测检测方式质量检测限（mol）浓度检测限（M）优缺点紫外-可见吸收10-13-10-1610-5-10-8接近通用型，二级管阵列可以给出光谱信息荧 光10-15-10-1710-7-10-9
