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1、生物医药基地 western blot 技术手册1. western blot 主要试剂的配方1.1 5电泳缓冲液配方(1L)Tris-Base15.1g甘氨酸Glycine94gSDS5g留意事项：a. 加水时应尽量避开气泡的产生，否则会造成过多SDS 的损耗。b. 配制好的溶液放于 4 度冰箱保存，使用时用纯水稀释至 1使用。1.2 1转膜液配方1L甘氨酸(Glycine)2.9gTris-Base5.8gSDS0.37g甲醇200ml留意事项：a.参与适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后参与甲醇溶液，最终用纯水定容至 1L甲醇气味大，通风厨内配制，并留意戴口罩。b.加水时应尽量避开气泡的
2、产生，否则会造成过多SDS 的损耗。1.3 10TBS 配方1LTris-Base24.2gNaCl80g留意事项：a. 参与适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整溶液的 PH 至 7.6一般溶解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调整PH 至 7.6 即可。b. 使用PH 计调整溶液的PH 前，要依据说明书校准PH 计。c. PH 调整至 7.6 后，用纯水定容至 1L，使用时稀释 10 倍至 1使用。d. 配制 TBST 时，在 1TBS 中依据 1:1000 的比例参与吐温 20 充分混匀即可。1.4 30%丙烯酰胺单体储存液配方100ml丙烯酰胺Acrylamide29gN,
3、N-亚 甲 双 丙 烯 酰 胺N,N-Methylene Bisacrylamide1g留意事项：a. 将各组分溶于总体积为 60ml 的纯水中，加热至 37完全溶解，用纯水定容至 100ml。b. 用装 0.45m 膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于 4冰箱保存。c. 丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并留意不要造成试验台面等的污染。1.5 上液1M Tris-HClPH=6.8配方50mlTris-Base6.057g三蒸水40ml留意事项：用浓盐酸调整 PH 至 6.8，再用三蒸水定容至 50ml，4冰箱保存。1.6 下液1M Tris-HCl, pH8.8 50mlTris-Base9.
4、08g三蒸水40ml留意事项：用浓盐酸调整 PH 至 8.8，再用三蒸水定容至 50ml，4冰箱保存。2. Western Blot 主要流程2.1 蛋白样品的提取2.1.1 常用裂解液及其特点2.1.2 医药基地常用蛋白质提取方法 RIPA 强裂解法：a. 取适量胰酶消化细胞针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步，收取细胞，PBS 洗两遍，600g 离心 5min，尽量去除 PBS，向细胞沉淀中参与适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF 的 RIPA 强裂解液80ul200ul 不等，依据自己细胞量的多少定。b. 冰上裂解 40min，每 5min 猛烈涡旋一次。c. 充分裂解后，14000rpm，4
5、离心 15min，将上清转至另一预冷的EP 管中不要吸到管底的沉淀。留意事项：a. 整个过程尽量在冰上操作，由于蛋白在常温降解速度很快，而在冰上则能显著的减慢这一过程。b. PMSF 有毒，留意戴手套，并留意不要造成试验台面等的污染。 SDS 煮沸法此方法对Caspase 家族切割条带具有特效：a. 收取细胞，PBS 洗两遍，600g 离心 5min，尽量去除PBS。b. 向细胞沉淀中参与适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF 的 SDS 裂解液80ul200ul 不等，依据自己细胞量的多少定。c. 将EP 管放在加热器上 95-100加热 20min 以上，加热至样品中的核酸粘稠物(细胞内核酸)完
6、全溶解为止。d. 充分裂解后，14000rpm，4离心 15min，将上清转至另一预冷的EP 管中不要吸到管底的沉淀。留意事项：a. 由于加热的温度很高为 95，煮沸的全过程中，不要离开蛋白样品，防止EP 管炸开而损失蛋白样品，甚至蛋白样品被蒸干。具体技巧与方法：放物体压住EP 管，待加热时间快完毕时，停顿加热，冷却到确定时间，轻轻拿开物体，轻轻拿出EP 管。b. 尽快将核酸粘稠物煮化，缩短提取蛋白时间。具体技巧与方法： 加热前适度涡旋，加热过程中用剪去尖端的枪头吹打样品。c. 提取的蛋白样品置于-20保存。细胞刮法针对贴壁细胞a. 倒掉培育基，PBS 洗培育皿 2 次。b. 吸尽残留的PBS
7、，参与预加了 PMSF 的SDS 裂解液 50-500Ul,快速用细胞刮将细胞刮下，并将裂解后的细胞转移到EP 管中，其他步骤同SDS 煮沸法。留意事项：整个过程尽量在冰上操作以减慢蛋白的降解。2.2 蛋白样品的定量本试验室承受BCA 法测定蛋白质浓度，具体步骤：a. 将各蛋白样品稀释 20 倍依据自己蛋白样品的浓度可加大稀释倍数至总体积为 40ul 或以上，以供每个样品 3 个复孔。b. 将蛋白样品和蛋白标准品参与 96 孔板中，每孔 10ul，每个样品 3个复孔。c. 配制显色液，充分混匀，参与 96 孔板，每孔 100ul。d. 37孵育 30min，酶标仪检测吸光度。留意事项：a. 尽
8、量将样品加在 96 孔板的中间位置，避开酶标仪检测时的边缘效应。b. 参与样品和显色液的过程中尽量避开气泡的产生。c. 选用准确度高的移液枪，尽量使用进口的枪头。2.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的配制2.3.1 不同浓度胶的最正确分别范围SDS- 分别胶浓度最正确分别范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD成分配制不同体积SDS- 分别胶所需各成分的体积(毫升)2.3.2 不同浓度胶的配制6%胶5ml10ml15ml20ml30ml50ml蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02
9、.03.04.06.010.01M Tris, pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS- 分别胶所需各成分的体积(毫升)8%胶5ml10ml15ml20ml30ml50ml蒸馏水1.73.356.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris, pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.2
10、0.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS- 分别胶所需各成分的体积(毫升)10%胶5ml10ml15ml20ml30ml50ml蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris, pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.0
11、2成分配制不同体积SDS- 分别胶所需各成分的体积(毫升)12%胶5ml10ml15ml20ml30ml50ml蒸馏水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris, pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS- 分别胶所需各成分的体积(毫升)15%胶5ml10ml15ml20ml30ml50ml蒸馏水0.51.01
12、.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris, pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02依据如下表格配制 SDS- 的浓缩胶也称为积存胶、上层胶5%胶2346810蒸馏水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris, pH6.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01成分配制不同体积SDS- 浓缩胶所需各成分的体积(毫升)2.4 Western Blot 主要步骤（1） 样品制备具体方法参见 2.1.2进展 Western 杂交时还需设置内或外参照，通常用 beta-actin 和GAPDH。留意事项：一般上样 2030 g 已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白， 可加大上样量至 100g，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份浓缩目的蛋白或承受更敏感的检测方法。（2） 电
