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1、细胞凋亡实验技术总结 一形态学检测1、光学显微镜和倒置显微镜观察法 未染色细胞:凋亡细胞体积变小、变形，膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩，变圆，脱落。染色细胞:姬姆萨染色，瑞氏染色等。凋亡细胞染色质浓 缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状，形成凋亡小体。2、荧光显微镜检测法 -荧光染料例如，碘化丙啶(PI )是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细 胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。选用536nm激发光，细胞核呈红色荧光。3、电子显微镜收集细胞， 2.5%戊二醛 4C 固定 24h， 1%四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋 剂浸透后环氧
2、树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。凋亡I期 的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。Ila期细胞核的染色质高 度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。4、激光扫描共焦显微镜技术FITC-AnnexinV+PI 双染，观察凋亡过程中细胞膜 PS 表面的变化，并区分正常细胞 (An-PI-)，早期凋亡细胞(An+PI-),晚期凋亡细胞及坏死细胞(An+PI+),细胞收集过程中出现 的损伤细胞(An-PI+)。二、细胞凋亡的生化及分子生物学检测1、DNA 断裂检测法如使用琼脂糖凝胶电泳检测，细胞凋亡时，核染色质凝聚，染色质DNA在核
3、小体单位 之间的连接处断裂。凋亡早期可形成 50300kbp 的 DNA 大片段，晚期核酸内切酶在核小 体之间剪切核DNA，产生大量长度在180200bp整数倍的寡核苷酸片段。2、膜联蛋白 V 法磷脂酰丝氨酸(PS)位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内 侧翻转到细胞膜表面。Annexin- V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷 脂结合蛋白，与PS高亲和力。将Annexin-V进行荧光素或生物素标记，以标记了的Annexin- V作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。3、细胞凋亡的酶Caspase检测检
4、测 Caspase 活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物，或用人工底物 检测酶活力,也可对活化的Caspase做亲和标记。例如分析底物的水解产物,PARP(多聚ADP- 核糖聚合酶)第一个被认识的caspase-3底物，它的相对分子质量为116000,水解后形成相对 分子质量为85000 及相对分子质量为25000 的两个片段，用抗相对分子质量为85000 片段 的抗体检测细胞是否发生凋亡。4、线粒体膜势能变化的检测线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的 增强或减弱反映了线粒体内膜电负性的增高或降低流式细胞仪检测细胞的荧光强度或荧光 显微镜观察，拍照正常细胞中, Rh123 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度 减弱或消失。而凋亡时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨 膜电位的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光。
