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1、CXCR4 基因转染对大鼠真皮多能干细胞生物学性状的影响 摘要目的：观察CXCR4 基因转染对大鼠真皮多能干细胞（dermal multipotent stem cells， dMSCs）分化、增殖、迁移等生物学性状的影响。方法：分别采用荧光激活细胞分类法、绘制细胞生长曲线法、细胞培养分化诱导法和Transwell 小室培养体系中化学趋化法， 观察CXCR4 基因转染后，CXCR4 阳性细胞数目以及dMSCs 增殖、分化和迁移能力的变化情况。结果：CXCR4 基因转染后，CXCR4 阳性dMSCs 数目明显高于对照组（P 005），dMSCs 增殖能力略高于对照组， 但差异无统计学意义（P 0
2、05）； 从Transwell 小室上层迁移到下层的dMSCs 明显高于对照组（P 005）。同时，转染CXCR4 基因的dMSCs 可向成脂、成骨、成肌细胞方向分化。结论：CXCR4 基因转染后，dMSCs 中CXCR4 表达增加，并有效地增强其迁移能力，且未影响dMSCs 的增殖和分化能力。关键词:多能干细胞； 真皮； CXCR4； 基因转染 基质细胞衍生因子1 （stromal-derived factor-1，SDF-1） 属于CXC 族趋化性细胞因子，CXCR4 是其唯一受体。研究表明，SDF-1 CXCR4 在胚胎发育、艾滋病的发病机制、肿瘤转移等过程中均发挥重要的作用。另外，SD
3、F-1 CXCR4 还参与调节生物体自身的或移植干细胞在体内的迁移和分布。为提高移植干细胞对损伤等的治疗效果，我们设想采用基因转染的方法使移植干细胞过表达CXCR4， 从而更多地分布到损伤部位，进而调高其疗效。本研究拟在体外实验观察我所构建的CXCR4 腺病毒表达载体对大鼠真皮多能干细胞（dermal multipotent stem cells， dMSCs）生物学性状的影响，为其在体应用奠定基础。 1 材料与方法 11 主要材料和试剂本研究所使用pAdEasy 系统构建的CXCR4 和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP） 的腺病毒表达载体Adv-CX
4、CR4 和Adv-GFP。Transwell 细胞培养小室购自Costar 公司，细胞培养用培养基、培养瓶、血清等购自Hyclone 公司。免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，荧光一抗rabbit polyclonal anti-CXCR4、二抗Anti-rabbit-RPhycoerythrin、myosin 一抗购自Sigma-Aldrich 公司。 12 大鼠dMSCs 的分离培养采用本研究所建立的早期贴壁法分离dMSCs，简述如下：新生1 d 大鼠，处死后剪取皮肤置于025胰酶消化过夜。次日，Hanks 液清洗后去除表皮和皮下组织，将真皮组织剪成细胞碎片并吹打成细胞悬液， 过滤后接种于培
5、养瓶中。6 h 后弃培养液和悬浮细胞，继续培养早期贴壁细胞。反复传代，按常规方法接种和选取细胞克隆， 并进行成骨、成脂和成软骨分化。鉴定好的dMSCs 传代备用。13 Adv-CXCR4 转染dMSCs 后CXCR4 表达变化的检测采用荧光激活细胞分类器（fluorescent activated cell sorter， FACS） 检测Adv-CXCR4 转染dMSCs 前后， 表达CXCR4 阳性细胞数目的变化情况。实验共设3 组：A 组，dMSCs 用Adv-CXCR4 转染；B 组，dMSCs 用Adv-GFP 转染；对照组，dMSCs 没有用病毒载体转染。操作步骤简述如下： dMS
6、Cs 传代并长到适当密度时加入05 mL 第10 代病毒原液，继续培养至细胞70左右融合时，弃培养液，磷酸盐缓冲液（PBS） 洗涤细胞2 次， 加入适量一抗（rabbit polyclonal anti-CXCR4），37孵育30 min 后用PBS 洗涤细胞3 次， 然后加入二抗，37孵育30min，PBS 充分洗涤细胞3 次。吹打收集细胞， PBS 洗涤细胞2 次，然后用500 L PBS 重悬细胞，并采用FACS 检测红色荧光细胞的阳性率。14 Adv-CXCR4 转染对dMSCs 迁移功能影响的检测在Transwell 小室培养体系中，观测病毒载体转染dMSCs 前后，dMSCs 在S
7、DF-1 的趋化作用下迁移能力的变化。实验分组同上。其操作步骤参照文献，简述如下：常规收集dMSCs，制成细胞悬液，细胞密度约106 mL。取100 L 细胞悬液， 接种于Transwell 小室内。每组重复4 个标本。孵育约1 h后，Transwell 小室外400 L 100 ng mL 的SDF-1。4h 后，取出Transwell 小室，PBS 冲洗， 用棉签轻轻擦去微孔膜上层的细胞， 95乙醇固定微孔膜下层细胞，苏木精染色后高倍镜下计数。取10 个视野的均数作为该样本从微孔膜上层迁移至下层的细胞数。15 Adv-CXCR4 转染对dMSCs 增殖影响的检测用绘制细胞生长曲线的方法观察
8、重组腺病毒载体转染dMSCs 后对其增殖影响。收集生长状态良好的dMSCs，调整其密度至1 104 mL。将dMSCs 悬液加入12 孔板，每孔100 L。其后12、24、48 和72 h，收集细胞计数。每个时相点每个组设4 个平行孔。实验分组同上。1 6 Adv -CXCR4 转染对dMSCs 分化影响的检测采用不同的诱导分化剂观察Adv-CXCR4 转染后dMSCs 成脂、成骨、成肌分化能力的变化。其中，成脂诱导分化培养液含10 6 mol L 地塞米松、05mmol L IBMX、10 g mL 胰岛素和105 mol L 吲哚美辛，诱导3 d 后改用10 mg mL 胰岛素的维持培基继
9、续培养14 d 后4多聚甲醛固定， 用油红O 染色观察脂肪滴的形成。成骨诱导培养液含108 mol L地塞米松、10 mmol L 甘油磷酸钠和50 mg L 维生素C，培养3 4 周后，01 mg mL 四环素染色后荧光显微镜下观察。成肌诱导使用含10 102 mmol L5杂氮胞苷的培养液。诱导2 周后， 固定行组织化学染色检测myosin 的表达。17 统计学方法计量资料采用方差分析和Dunnett t 检验，计数资料采用卡方检验。2 结果21 Adv-CXCR4 转染dMSCs 后CXCR4 表达的变化情况dMSCs 转染Adv-CXCR4 后3 d，CXCR4 细胞阳性率即可达到21
10、4，12 d 左右达到高峰， 约为830，约为对照组的7 倍。转染后21 d，仍然有较高的阳性率，约为626。而B 组和对照组阳性细胞比例波动在113 142 ， 远低于A 组（P 005）， 表明Adv-CXCR4 基因转染可有效地使dMSCs过表达CXCR4。22 Adv-CXCR4 转染对dMSCs 迁移功能的影响在浓度为100 ng mL SDF-1 的作用下，A 组中迁移到小室下层的dMSCs 数量为358 21， 远高于后二者（ 分别为99 12 和112 10）， 差异有显著性（P 005）。结果提示，Adv-CXCR4 转染后，dMSCs 过表达CXCR4， 可在SDF-1 的
11、作用下， 更多地迁移到Transwell 小室下层， 即其迁移能力明显增强。23 Adv-CXCR4 转染对dMSCs 增殖的影响图2显示的是各组dMSCs 在不同时相点的增殖情况，可见在不同的时相点，A 组dMSCs 增殖活性均高于B组和对照组，但差异没有统计学意义（P 005）。上述结果提示，Adv-CXCR4 转染对dMSCs 的增殖活性没有负性影响，且有轻度的促增殖作用。24 Adv-CXCR4 转染对dMSCs 分化的影响dMSCs在诱导剂的作用下， 可被诱导为骨细胞、脂肪细胞和肌细胞， 即Adv-CXCR4 转染没有影响dMSCs的分化能力。3 讨论目前的研究表明，将成体干细胞应用
12、于损伤组织的修复，可取得良好的效果。在前期的研究中，我们分离培养鉴定了大鼠dMSCs，然后将其移植到放射损伤复合皮肤创伤（放创复合伤）大鼠体内，发现其可明显缩短创面愈合时间，促进造血功能的恢复。进一步的研究表明，相对于肝脏、肺脏等未受损伤的组织，移植的dMSCs 可优势分布到骨髓和创面， 且皮肤创面和骨髓局部上调表达的SDF-1 在趋化移植dMSCs向伤部的优势分布中起到重要作用。但放创复合伤大鼠由于静脉输注的dMSCs 在伤部的含量仍相对有限， 因而我们设想将CXCR4 全长cDNA 克隆到病毒表达载体中， 转染dMSCs， 增加dMSCs 中CXCR4 表达水平， 从而在损伤局部高表达SD
13、F-1 的趋化下，促进移植的dMSCs 更多地分布到损伤局部。pAdEasy 系统是常用的构建腺病毒表达载体之一，转染入宿主后， 其DNA 不整合到宿主基因组，对宿主的基因组表达和遗传无影响。因而，我们采用此系统构建了CXCR4 的腺病毒表达载体， 并命名为Adv-CXCR4。本研究在体外观察Adv-CXCR4转染dMSCs 后对后者分化、增殖和迁移等的影响，以明确其是否可用于在体。结果表明，Adv-CXCR4转染dMSCs 后， 可有效地增加dMSC 中CXCR4 的表达， 且这些过表达的CXCR4 可增强dMSCs 的迁移能力。这就符合我们预先的设想，即通过过表达CXCR4 的方法促进移植的dMSCs 更多地分布到损伤局部，以更好地促进损伤组织的修复。同时，转染Adv-CXCR4 后， dMSCs 的分化功能未受影响， 增殖轻度增快， 提示在体移植Adv-CXCR4 转染的dMSCs 可能仍能够发挥其组织修复的作用。上述研究结果为我们进一步的在体实验奠定了良好的基础。
