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1、分子生物学实验手册 (第二版)A Handbook of Molecular Biology Experiments 武汉工程大学化工与制药学院生物学工部实验总流程实验一 聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验目的：1、获取目的基因。2、学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法。材料与试剂：阳性克隆菌落、PCR引物、Taq酶、dNTP、10PCR buffer、dd H2O。实验原理：PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR分为质粒PCR和菌落PCR，前者指提取阳性克隆
2、菌质粒后进行PCR，后者指直接挑取阳性克隆单菌落，直接用菌落做PCR，本实验中采用后者。它包括三个基本步骤:：(1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94下解链；(2) 退火(Anneal)：人工合成的两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；(3) 延伸(Extension)：耐热的DNA聚合酶即Taq酶在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异
3、性以及引物二聚体的形成等。由上面三个基本步骤组成一轮循环，这样模板上介于两个引物之间的片断不断得到扩增，目的DNA以2n-2n的形式堆积。（动画演示：http:/ 取100 l dd H2O（双蒸水）至Eppendorf管（以后简称EP管），用微量移液管（俗称“枪”）Tip头（俗称“枪头”）从平板上挑取阳性克隆单菌落，将其混合到dd H2O中，沸水浴约10分钟。煮沸的目的就是使菌体裂解，释放出可以做为模板的DNA。2、 配备100 l PCR反应体系（用PCR小管）：3、 25l DNA；10PCR buffer 10l；2mM dNTP 10l；2种引物（10M）各5l；Taq（5U/l）1
4、l；ddH2O 44l。4、 将PCR小管放入PCR仪，盖好盖子，在PCR仪上设定以下反应条件：5、 93 变性3 min后，进行30个循环的反应：92 变性40 sec，55 退火45 sec，72 延伸1 min；最后72 延伸5 min。PCR结束后温度设为4 。6、 反应结束后，取出PCR小管。产物置冰箱4保存待用。实验二 琼脂糖凝胶的制备及电泳检测实验目的：1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理、方法；2、检测PCR产物是否含目的基因。材料与试剂：1、PCR产物。2、琼脂糖（Agarose），注意不是琼脂粉（Agaragar）。3、50TAE 缓冲液：Tris 242 g、冰乙酸 57.1 m
5、l、 0.5 mol/L EDTA 100 ml ，加入600 ml dd H2O后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后湿热灭菌，室温或4保存；使用时可用ddH2O稀释。4、Loading Buffer，即上样缓冲液，含有溴酚蓝，Loading Buffer作用有两个，一是作为缓冲液，以稳定DNA的迁移率，另一作用是可以指示DNA泳动的距离。5、Marker：用来指示DNA分子大小的参照，本实验中使用到的Marker梯度为250bp，即在电泳中跑在最前面的为250 bp，其次是500 bp，750 bp实验原理：核酸分子是两性解离分子，在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而3个磷酸基团中只有第一个
6、磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0-8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动；不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异而得以分离。电泳后用EB（溴化乙锭）染色，在紫外照射下DNA发出橙色光，将其泳动的距离与Marker作比较就可以判断其分子大小，用这种方法至少可以检测出1-10 ng的DNA。本实验中目的基因大小为600bp，因此电泳时其条带位于Marker的第二条带与第
7、三条带之间。注意：EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴双层手套，凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。实验步骤：1、 称取1 g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入2 ml 50TAE缓冲液，加水至100 ml。2、 用微波炉（或电炉）加热至琼脂糖完全溶解。3、 待上述胶液稍冷后，将其倒入插好梳子的模具中。4、 待琼脂糖溶胶完全凝固后，小心取出梳子，将凝胶放到电泳槽中,注意使加样孔靠近负极。5、 向电泳槽中倒入1TAE缓冲液，至液面略高于凝胶。6、 取 10 l DNA与 2 l Loading Buffer在点滴板（或用一次性手套）上混匀，加入到凝胶加样孔中。留一加样孔（一
8、般在正中间）加Marker，Marker（5l）也要与2l Loading Buffer混合后再加。7、 接通电源，设定电压，电压降选择为1-5V/cm。电压不宜过高，一般不超过120 V，否则会使琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小（这是因为随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大）。8、电流完毕后切断电源，取出凝胶，放入EB溶液（0.5 g/ml）中进行染色10-15 min。清水漂洗后置于紫外照射仪上观察，然后利用成相系统拍照保存。实验三 回收纯化DNA片断实验目的：1、掌握DNA回收与纯化的原理及方法；2、回收目的D
9、NA。材料与试剂：PCR产物、电泳检测相关试剂、AXYGEN试剂盒。实验原理：通过PCR扩增得到的DNA中含有很多杂质，如缓冲液中的盐类、Taq酶、dNTP，还有引物二聚体以及原来阳性克隆中的完整质粒等，这些杂质会影响连接效率，因此需要除去。将PCR扩增得到的DNA进行电泳后可以使目的基因与引物二聚体以及原来阳性克隆中的质粒DNA分离开，然后利用回收试剂盒中的试剂将DNA从电泳凝胶中分离以及进一步纯化。实验步骤：1、 将上一实验剩余的PCR产物（约90 l）进行电泳分离，其操作同实验二。2、 （以下内容由试剂盒内说明书翻译过来）在紫外照射下，将含有PCR 产物DNA片段的凝胶用刀切下，吸去残余
10、的缓冲液，并切碎，放入EP管中称重，将称得的凝胶质量当作其体积。如100 mg凝胶就相当于100 l体积。然后将凝胶转至1.5 ml Microfuge tube。 注：可将 Microfuge tube 于12000 r/min离心30 sec 使凝胶位于管底。3、 加入3凝胶体积的DE-A缓冲液。例如：100 l凝胶则加入300 l DE-A。4、 涡旋使凝胶悬浮并溶解于DE-A缓冲液中，加热至75至凝胶全部溶解（一般需要68 min） 注：凝胶须全部溶解，否则会影响NDA回收率。凝胶加热时间不宜超过10 min。5、 加入0.5DE-A缓冲液体积的DE-B缓冲液,混匀。例如：100 l凝
11、胶则加入150 l DE-B。6、 将一个Miniprep column 放到一个 2 ml Microfuge bube 中，将上一步溶解的凝胶放到column 中，12000 r/min 离心 60 sec。7、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge tube 中，加入500 l W1缓冲液，然后 12000 r/min 离心 30 sec。8、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge tube 中，加入700 l W2缓冲液，然后 12
12、000 r/min 离心 30 sec。9、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge tube 中，加入700 l W2缓冲液，然后 12000 r/min 离心 60 sec。 这两步操作的作用是除去凝胶中的盐类、Taq酶等蛋白质。10、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge- tube 中，12000 r/min 离心 1 min。11、 将Miniprep column 转至 1.5 ml Microfuge tube ，加入2530
13、l洗脱液 (Eluent) 到column 中心的滤膜上。在室温下放置 1 min，然后12000 r/min 离心 1 min。注意：此时目的DNA被洗脱到Microfuge tube中，切勿误倒！12、 将洗脱得到的DNA取5 l进行电泳检测，确保回收成功（即回收液中确实含目的DNA），将回收成功的洗脱液放入冰箱，4保存待用。实验四 外源DNA在质粒载体中的克隆(连接)实验目的：1、学习将质粒与目的基因连接的原理及方法；2、将目的基因连接到T载体上，为转化作准备。材料与试剂：回收得到的DNA、T载体、T4连接酶、缓冲液实验原理：在PCR的延伸阶段，Taq酶能自动催化产物3末端加上多个腺嘌脱
14、氧核苷酸（即ploy（A），pGEM-T和pGEM-T Easy载体利用了这一结果（这两种统称“T载体”，二者的区别是pGEM-T Easy载体的多克隆位点在插入序列的两端带有NoT I和 EcoR I切割位点），载体经EcoR V线化后，在3末端加上一系列T，在T4连接酶的作用下可直接克隆PCR产物。连接实验时，PCR产物不需酶切，和T-载体的连接类似于高效粘性末端的连接。实验步骤：1、 配备连接反应10 l体系（用EP管）：2、 3 l外源DNA；1 l载体；2buffer 5 l；1 l T4 ligase 加入各试剂后，可3000 r/min 瞬时离心，使试剂聚集到EP管底。3、 室温
15、下放置 1 h后放入冰箱内4 过夜。实验五 感受态细胞的制备实验目的：1、学习感受态细胞的制备；2、制备感受态细胞，为导入目的基因作准备。材料与试剂：1、 大肠杆菌菌株 DH5。2、 LB液体培养基：NaCl 10gYeast extract 5gPeptone 10gAdd ddH2O to 1000ml调节pH至7.0，加热搅拌使固体全部溶解均匀，扎口后湿热灭菌处理。常温下放置或冷却后置冰箱4 保存。3、 0.1 mol/L CaCl2溶液：配制好后放入冰箱4保存。实验原理：受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过，这种被处理的细胞叫感受态细胞（Competent cell）。目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2或RbCl(KCl)法处理细菌的方法制备，RbCl(KCl)制备的感受态转化效率较高，但CaCl2法操作简便。CaCl2法原理是利用低渗CaCl2溶液在低温（0 ）时处理幼嫩的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌
