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1、NC市科技计划项目可行性研究报告项目名称：脐血间充质干细胞喷雾剂及修复创面的实验研究 计划类别： 重大项目 申报单位（盖章）： NC大学第二附属医院 联系人： H G G 联系电话： 1000000018 通讯地址： NC市MD路1号 管理部门： JX省卫生厅 NC市科技局二XX年X月XX日NC市科技计划项目可行性研究报告编写提纲一、总论（一）项目的主要内容及技术原理简述（二）项目的目的和意义（三）相关技术领域国内外发展现状、趋势（四）项目主要负责人的基本情况（五）有关本项目的现有工作基础和支撑条件二、项目实施方案（一）项目达到的目标及考核的主要技术经济指标（含知识产权、技术标准）（二）项目的
2、主要研究（开发）内容（三）试验（开发）规模及地点（四）主要技术关键及创新点（五）实施方案（含技术路线、工艺流程及技术关键的解决方案）（六）分年度的工作内容、目标（七）申请单位、合作申请单位及主要人员的分工（八）组织及管理的运行机制（九）相关依托工程（含技术）的落实情况（十）有关本项目的国内外知识产权状况分析三、技术、经济效益分析（含市场风险分析、推广应用前景及产业化可行性）一、总论（一） 项目的主要内容及技术原理简述研究目的是为皮肤缺失患者提供一种新型皮肤替代物。从脐血中提取MSCs，并进行培养、纯化、扩增及表型鉴定，然后将其向表皮干细胞定向诱导培养并行表型鉴定；用培养基、水溶性无毒高分子材料
3、等研制一种成膜喷雾剂；然后将诱导的细胞与喷雾剂混合后培养，制备含细胞的成膜喷雾剂。细胞促进创面的功能性修复；喷雾剂于肌体表面后迅速干燥并形成一层多孔性的高分子膜，具有良好的透气性，起到保护创面，防止细菌侵入的作用；用小型香猪制备烧伤动物模型，创面随机分为空白对照组，喷雾剂组，治疗A组，治疗B组。空白对照组用生理盐水喷雾到创面；喷雾剂组仅单纯覆盖喷雾剂；治疗A组用未经诱导的MSCs喷雾剂覆盖；治疗B组用经体外定向诱导的MSCs喷雾剂覆盖。观察创面愈合情况，并取材行组织学、电镜、双色免疫荧光、PCR及原位杂交等相关检测。预期该替代物细胞来源方便，而且可采用自体或配型相近的MSCs，治疗过程相对简单
4、，并且可促进受损创面修复后的功能重建。（二） 项目的目的和意义大面积烧伤或创伤的患者，常由于缺乏可供移植的自体皮肤，创面修复困难，严重影响肢体功能与形态，甚至导致死亡。如何防止种子细胞的老化和构建血管化、含皮肤附件、可冻存，并有抗排斥能力的复合皮是组织工程皮肤的发展方向。本项目预构建增殖能力强的血管化的组织工程皮肤，具有很强的临床实用性，并为大规模产业化生产奠定基础，因而有着极其巨大的社会和商业价值。（三） 相关技术领域国内外发展现状、趋势大面积烧伤或创伤的患者，常由于缺乏可供移植的自体皮肤，创面修复困难，严重影响肢体功能与形态，甚至导致死亡。目前，临床上运用各种手段对大面积深度烧伤创面进行覆
5、盖，其结果是消灭了创面，挽救了患者生命。但不足之处是普遍存在愈合后的表皮薄，不耐摩擦，易起水疱及无毛发和排汗功能等缺陷，严重影响患者的生活质量。推测其原因主要为移植的细胞是增殖、分化能力差的较老化细胞。促进受损创面修复后的功能重建已成为组织修复领域从基础研究到临床治疗需要解决的重大难题，具有重要的理论意义和临床应用价值1。脐带血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，主要包含造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCS）。脐血作为一种具有全能干细胞特点的细胞，为中胚层发育的早期细胞，具有多项分化潜能，其形态和生物学特点与骨髓源性MSCS相似。国内外已有大
6、量的实验证实骨髓MSCS还可以向中胚层和外胚层来源的组织分化，在一定条件的控制下可分化为肌细胞2、成骨细胞3、4、脂肪细胞5、神经细胞6、肝细胞7、心肌细胞8和表皮细胞9、10。Krause11等通过鼠骨髓移植实验和Korbling12等通过对人骨髓移植的患者的检测发现，MSCS在体内可以分化为表皮细胞，并可以长期存在。因此，有关MSCS能否跨胚层转化为上皮细胞的科学问题已得到初步解决。由于骨髓源性MSCS存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCS，并可弥补其缺陷的MSCS，已成为研究的热点。研究已证实脐血MSCS诱导分化后
7、也能成为神经细胞13、心肌细胞等14。人脐血MSCS可替代骨髓MSCS15，即使冷冻保存后，也可作为实验、临床及组织工程的细胞来源16。于骨髓相比，脐血源性MSCS优势在于：脐血有更充足的来源，脐血收集容易；脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的几率低；脐血的免疫源性更低，能耐受更大程度上的HLA配型不符；脐血包含丰富的干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的扩增、分化能力；妊娠3个月的脐带血在含10胎牛血清的条件下，可以扩增至少20代，平均积累细胞50.34.5，其中含有大量的MSCS；收集的脐血不仅可做异基因移植的供体，而且还可将之低温保存数10年，用于自体移植治疗相关疾
8、病。因此，自体细胞就可作为组织工程的种子细胞17；虽然存在异体移植的问题，一方面脐血干细胞抗原性弱，另一方面目前全国很多城市均在建立脐血库。据山东省脐血库3000份脐带血测试，所存储的脐带血具有3个以上HLA位点与待查病人的相合几率为100，6个HLA位点相合的几率为5。如病人所需最低单个核细胞为2.7107/kg,则所存脐带血中有近50可供体重为50kg左右病人应用。故脐血干细胞的作用越来越突出，可作为一种新的替代细胞来源用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗。随着脐血库的建立完善及脐血体外扩增技术的成熟，为脐血的临床应用奠定了坚实的基础。MSCS的表型不均一，具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞的
9、特点，即MSCS可表达多种黏附相关分子，如整合素亚基a3、a4、a5、以及整合素ICAM1，CD44H等。它对表面抗原SB-10、SH2、SH-3、CD29、CD44、CD90、CD106、CD120a和CD124等均呈阳性反应18，而对造血细胞的CD14、CD34、CD45抗原均呈阴性反应，也不表达以下上皮细胞和上皮干细胞的表型：如pan-cytokeratin,cytokeratin19(K19),cytokeratin5/8(K5/8)以及整合素6等。目前没有发现公认的MSCS特异性表面抗原，无直接方法可鉴定MSCS，都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为骨髓MSCS18、
10、19。近来，随着对MSCS研究的深入，逐渐发现MSCS在损伤等刺激下能参与多种组织的修复，其机制尽管尚未完全阐明，但初步结果显示可能与创伤的刺激及局部创面的微环境中含有各种不同的因子有关，它们具有促进MSCS趋化以及诱导MSCS向所需要的组织或细胞分化来参与组织的修复。细胞分化依赖于细胞处的三维空间结构和相应的多维分化信号20。细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用直接影响干细胞的分化方向和进程。周边环境对其增殖、分化有重要作用。生物体提供了复杂微妙的微环境。我们可以借助生物体本身来进一步完成多种干细胞的诱导分化。呼和塔娜21报道将体外培养扩增的雄性豚鼠骨髓MSCS移植皮肤深度烧伤的雌性豚鼠创
11、面，结果发现治疗组的皮肤创面修复较好，真皮与表皮结构清晰，表皮各层清楚，真皮层胶原纤维排列整齐；而对照组的皮肤创面细胞各层次不清楚，真皮层胶原纤维排列不规则。随着人们对修复质量要求的不断提高，如何使受创组织达到解剖重建与功能修复乃至“完美愈合”已成为当前组织修复中需要解决的重要问题。由于MSCS取材方便，治疗过程相对简单，采用自体MSCS移植对提高修复质量，特别是皮肤附件的再生可能是一条可行的途径1。MSCS移植到受损创面后，肉芽组织及新生表皮中存在MSCS来源的血管内皮细胞和表皮细胞9、10并初步发现MSCS参与了皮脂腺导管的构成。这些都构成了采用自体MSCS移植提高创面愈合质量的基础。本项
12、目预采用无血清培养方法培养MSCS，可以避免由于血清中存在的复杂因子给移植物带来的免疫源性，避免含血清培养中病毒等病原体污染，不含有毒物质，符合创面修复要求，可更安全地应用于临床。本项目拟试制一种成膜喷雾剂，它可携带定向诱导后的MSCS喷到创面。其特征在于在喷雾前是液体状态，喷雾于机体表面后迅速干燥并形成一层多孔性的高分子膜，具有良好的透气性22。成膜剂在创面较早形成一个保护膜，起到了保护创面，防止细菌侵入的作用，并临时替代了剥脱表皮的功能，减轻疼痛、渗出，预防创面继发性感染。水溶性高分子材料如羟甲基纤维素、聚维酮等作为口服药片的包衣剂，对人体和细胞均无毒。壳聚糖来源丰富，无毒，无污染。它作为
13、一种新型的成膜剂，不仅能成膜，而且能有效抑制细菌入侵和生长23。局部应用MSCS治疗促进皮肤创面愈合，提高愈合质量，可能通过以下几种途径：MSCS分泌的细胞因子和生长因子促进创面肉芽组织的形成、再上皮化及附件的再生；MSCS转化为表皮细胞、血管内皮细胞及皮肤附件的某些结构参与修复。由于脐血MSCS取材方便，用喷雾剂携带治疗过程相对简单，而且采用自体或配型相近的MSCS对提高修复质量，特别是皮肤附件的再生可能是一条可行的途径，预期有着广阔的研究和临床应用前景。参考文献1FuXB,FangLJ,WangYX,etal.Enhancingtherepairqualityofskininjuryonp
14、orcineafterautograftingwiththebonemarrowmesenchymalstemcellsJ.NatlMedJChina,20YY,84(11)920-924.2WakitaniS,SaitoT,CaplanAI.Myogeniccellderivedfromratbonemarrowmesenchymalatemcellexposedto5-azacyudineJ.Musclenerve,1995,18:417424.3KadiyalaS,YoungRG,ThideMA.Culturedexpandedcaninemesenchymalstemcellsposs
15、essosteochondrogenicpotentialinvivoandinvitroJ.CellTransplant,1997,6:125133.4MachayAM,BeckSC,MurphyJM,etal.ChondrogenticdifferentiationofculturedhumanmesenchymalstemcellsfrommarrowJ.TissueEng,1998,4(4):4155PittengerMF,MachayAM,BeckSC,etal,MultilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcellsJ.Science,1999,284(5411):143147.6AziziS,StokesD,AugelliBj,etal.Engraftmentandmigrationofhumanbo
