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1、候选蛋白的验证技术 免疫印迹法（blotting）:是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 免疫组化法n 免疫荧光法u 流式细胞术 免疫印迹法l Western BlottingWB=SDS-PAGE电泳+将分离的多肽从凝胶转移至固相支持体+抗原抗体反应步骤：制胶蛋白样品制备和上样电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色1. SDS-PAGE电泳原理加入SDS破坏蛋白质的氢键、疏水键，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物，大量SDS结合后，让各种蛋白都带上相同的负电荷（远大于原有电荷量，原有电荷量忽略）和破坏部分的蛋白质空间结构；加入-巯基乙醇破坏二硫键
2、，破坏蛋白质的空间结构。最终蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量。在电场作用下，带有负电荷的蛋白质，向胶板下方移动（+极），分子量小的蛋白质所受阻力小电泳快，位于胶板最下方，分子量大的相反，各蛋白质依分子量被分散于电泳道各处。在不连续电泳时，采用了两种缓冲液，其凝胶孔径、pH值、电泳电压和PAGE浓度不同。上层胶为浓缩胶（大孔径，PH6.8，PAGE 5%），下层胶为分离胶（分子筛，PH8.8，电压120V，PAGE根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度）。浓缩胶中的缓冲对为Tris-HCl，电泳Buffer的缓冲对为Tris-甘氨酸。胶中的Cl-移动最快，电泳Buffer中的甘氨酸（pI
3、为6.0）在浓缩胶pH6.8时解离度很小，故移动最慢。而SDS-Protein 在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移动速度居第二。即泳动速度为Cl- 蛋白甘氨酸离子。加上电压后，氯离子和甘氨酸离子分离开来，在二者之间形成一个导电性较低的区带（因为之间电荷少），由于导电性和电场强度成反比，这一区带的电压梯度较高，又反过来加速位于区带后方的甘氨酸离子的泳动，使其追赶氯离子，建立甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速度乘积相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同的速度泳动（这两种离子之间有明显的边界，电泳调节一定的情况下，此高电压梯度带宽度不变）。蛋白质则以相同的速度和相对固定的位置在此高电压梯度带中泳动，同时受此
4、高电压梯度影响，蛋白质分子被堆积在一起，形成一条狭窄的条带。当此高电压梯度带移动到浓缩胶和分离胶界面时，凝胶PH增高，大量甘氨酸解离并带上负电荷，此时甘氨酸的泳动速率明显增加，超越蛋白质分子，位于氯离子后，使高电压梯度带缩窄，蛋白质则不再位于该带内，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和PH环境中泳动，并根据其固有分子量大小进行分离。2. 制胶（先下后上）配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶，按需配体积)：成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%胶2346810蒸馏水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50
5、.671.01.31.71M Tris-HCl,pH6.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵（AP）0.020.030.040.060.080.1TEMED（1V）0.0020.0030.0040.0060.0080.01依据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度(实质就是丙烯酰胺的浓度)，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD成分配制不同体积SDS
6、-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1V）0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶51015203050蒸馏水1.73.35.06.710.016.730%Acr-B
7、is(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1V）0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.0
8、10%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1V）0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）12%胶51015203050蒸馏水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1
9、V）0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）15%胶51015203050蒸馏水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1V）0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：AP和TEMED是促凝剂，量适当就好，温度高需适当减量，避免过
10、早凝固。不要有气泡，不要漏水、分离胶（1.5mm板多配10毫升体积，高度可调节，至少加到卡槽线；上样枪头要垂直）在一边贴壁流下，少量无水乙醇（压胶，使成水平）均匀由各处流下，待凝固30min（不可过久，否则将吸走分离胶中水分）。倒出多余无水乙醇（醇封需要用ddH2O洗板），在一边贴壁加入配置好的浓缩胶，依据估计上样体积安装适当齿梳，待凝固40min。成胶后缓慢拔出齿梳，用去离子水赶出泳道内气泡（不要对着冲），侧置胶板用滤纸吸出可流出的去离子水（不必全部吸干，操作在保证不损坏胶的前提下进行）。组装仪器，倒入Running Buffer（内槽新液，外槽旧液）。细安装、查漏水、（RB）内过板、外过线
11、、红对红、黑对黑3. 蛋白样品制备和上样蛋白样品制备，用RIPA Buffer/生理盐水/超声等充分裂解细胞。成分RIPA Buffer所需各成分量和作用 Tris-HCl, PH8.0?50mM缓冲对，防止蛋白变性NP-401%非离子型去污剂，裂解细胞Na-deoxycholate1%离子型去污剂，溶解细胞膜 NaCl150mM防止蛋白非特异性的聚合SDS0.1%强离子型去污剂，裂解细胞PMSF0.05mM蛋白酶抑制剂之一注：1.激酶的实验禁加Na-deoxycholate，其可变性激酶蛋白，并使其失去活性。 2.磷酸酶的实验禁加磷酸酶抑制剂。 3.离子型去污剂存在极性头部基团，去污活性较强
12、，尤SDS。SDS会使蛋白质变性并破坏其三维结构，因此当研究蛋白质活性或蛋白质相互作用存在时，禁用SDS。如需去除蛋白质的SDS，可利用SDS低温沉淀特性，钾盐液中更明显。不能通过离子交换色谱去除。 4.非离子型去污剂没有极性的亲水基团，是比较温和的表面活性剂，并且多数不能使蛋白质变性，可保留蛋白的天然构象、功能及它们的相互作用。注：用上样针（每次洗5遍）选择适当蛋白上样量（太大上样量会造成“过载”，膜无法完全吸附所需蛋白，反而没条带）。上样时为了简便操作，建议上样体积v相同（m =c * v）。上样前分别测各蛋白样品浓度，用Loading Buffer或裂解细胞的RIPA Buffer配平各
13、上样蛋白浓度（使各组蛋白质浓度相同）并于100 ，10min加热，终止可能的酶促反应，防止提取的蛋白质降解。空白泳道用Loading Buffer填充(最终使混液变为1X的Loading Buffer)。加入已知分子量的一系列蛋白混液作为确认分子量的Marker。1.5mm/10泳道胶板：满孔体积50L，上样体积最好不过其2/3，可选30L上样体积。1.0mm/10泳道胶板：满孔体积30L，可选20L上样体积。主要成分Loading Buffer所需各成分作用Tris-HCl, PH6.8缓冲对，调节PH甘油增加样品密度，从而沉降于点样孔中，避免飘出0.1%溴酚蓝（BPB）指示剂，紫兰色，显示电泳过程二甲苯氰FF指示剂，兰色，显示电泳过程SDS（部分有）变性酶类，终止酶促反应，破坏氢键、疏水键，加入负电荷5%-巯基乙醇破坏二硫键4. 电泳红对红、黑对黑、调参数、适时停（溴酚蓝到交界）。回收Running Buffer浓缩胶参数：80V，30mA恒压。原因：低电压可以避免高电压梯度带过宽，使在蛋白移动到浓缩胶和分离胶界面时，甘氨酸仍远未到，甚至让蛋白在分离胶中的泳动也收到该高电压带影响，而产生偏
