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1、第二十一章 血栓与止血检验的基本方法第二十一章血栓与止血检验的基本方法?血栓与止血检查的基本方法本章考点1.血栓与止血的概述与概念2.筛查试验 （1）一期止血缺陷筛查试验（2）二期止血缺陷筛查试验3.血管壁检验 4.血小板检验 5.凝血因子检验 6.生理抗凝蛋白检验 7.病理性抗凝物质检验 8.纤溶活性检验9.血液流变学检验 重点：掌握筛查试验以及血小板、凝血因子检查项目、临床意义难点：1.血小板相关检验2.血栓前状态检验一、血栓与止血的概述与概念1.血栓：血栓是流动血液的血液成分在血管或心脏内膜形成的病理性非匀质性的凝块或沉积物。在血管系统中，血栓可使血管发生完全性（微小血管及存在狭窄的中动
2、脉）或不完全型阻塞（大动脉），影响血液流动。止血栓与血栓相似，但因血管壁损伤较轻，其形成比较局限，且血液始终能流经其表面，故血管阻塞大多为不完全性。任何部位血管内都可发生血栓。静脉血栓常为红色血栓，其发生常与血流过缓、淤滞有关；动脉血栓的发生与动脉粥样硬化病变有关，血小板激活和在病损动脉管壁的黏附和聚集是血栓形成的基础，因而主要是白色血栓或混合血栓。2.凝血：当血管损伤时发生出血，可通过血管收缩、血小板止血栓形成和血液凝固，使小血管的伤口堵塞，流血停止，避免过度失血，这就是机体的止血反应。血液由溶胶状流体转变为凝胶状固体的过程称为凝血反应。凝血反应是生理性止血机制中一个十分重要的环节，血管损伤
3、时止血栓的形成是机体发挥正常止、凝血功能的结果。在上述构成止血功能三个主要环节中，凝血反应是一种高度调节性的生化反应。二、一、二期止血缺陷筛查试验（一）一期止血缺陷筛查试验概述：是用于检查血小板、血小板和血管内皮相互作用是否正常的试验。它涉及到血小板的数量、功能、血管内皮细胞的功能以及两者相互作用等方面。 1.出血时间（BT）（1）原理：测定在皮肤受特定条件外伤后，出血自然停止所需的时间即为出血时间。BT反映了毛细血管与血小板的相互作用，包括内皮下组织与血小板粘附（通过vWF的作用）、血小板的聚集和释放等反应，以及PGI2与TXA2的动态平衡。（2）参考值（出血时间测定器测定法）：2.59.5
4、min（lOmin为延长）。（3）临床意义：出血时间延长见于血小板减少症；先天性血小板功能异常，如血小板无力症、血小板贮存池病；获得性血小板功能异常，如尿毒症、药物影响、异常蛋白血症、骨髓增生性疾病；血管性血友病；遗传性血管周围结缔组织病如艾-唐综合征。一般凝血因子缺乏出血时间不延长，但某些严重的因子缺乏（如因子和）及无纤维蛋白原血症可以延长。出血时间缩短见于某些严重的高凝状态和血栓性疾病。此外，出血时间还广泛用于外科手术前的出血筛选和抗血小板药物的监控，以免发生出血。（4）注意事项：试验前一周患者应停服阿司匹林、噻氯吡啶等抗血小板的药物。2.束臂试验（CFT）（1）原理通过前臂局部加压，使静
5、脉血流受阻，给予毛细血管以负荷，观察前臂皮肤一定范围内新出现的出血点数目，来估计血管壁的完整性及其脆性。（2）参考值：5cm直径圆圈内新出血点的数目：男性少于5个；女性及儿童少于10个。（3）临床意义：新出血点的数目超过正常为阳性，见于：血管壁结构和（或）功能缺陷，如：遗传性出血性毛细血管扩张症、过敏性紫癜、单纯性紫癜及其他血管性紫癜。血小板的量和（或）质异常，如：原发性和继发性血小板减少症、血小板增多症、先天性（遗传性）和获得性血小板功能缺陷症。血管性血友病（vWD）。图6 1期止血缺陷过筛试验结果分析示意图（二）二期止血缺陷过筛试验概述：是检查凝血因子有无缺陷的试验。1.凝血酶原时间测定（
6、PT）（1）原理：在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶（人脑、兔脑、胎盘及肺组织等制品的浸出液）和钙离子，使凝血酶原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需时间即凝血酶原时间。该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验。（2）参考值及报告方式：直接报告患者及正常对照的PT秒数。参考值为1114s，超过正常3s为异常。报告凝血酶原时间比值（PTR） PTR=受检者PT（秒）正常对照PT（秒，宜用多份正常人血浆PT的几何均数，或其混合血浆的PT），参考值为10.15。 报告国际标准化比值（INR）：需先求得所用组织活酶的国际敏感度指数（ISI），它是所用组织凝血活酶与ISI已知的国
7、际参比品或经其标定过的参比品之间敏感度相比较的一个参数。测定方法是用多份凝血因子水平不同的血浆（包括正常人和口服抗凝剂患者的血浆），用参比品测得它们的PT的对数（log PT），再用待标定的组织凝血活酶测得它们的log PT，以前者为纵坐标，后者为横坐标作图，经回归求得直线斜率。则待标定的组织凝血活酶的ISI=已知ISI斜率。ISI值越低，试剂对有关凝血因子降低的敏感度越高。再按下式求得INR：INR=PTR ISI。（3）临床意义：PT延长见于遗传性外源凝血系统的因子、和纤维蛋白原减低，但均很少见。肝脏疾病：由于外源性凝血因子主要在肝脏合成，因而肝脏疾病时，PT延长。维生素K缺乏症：胆石症、
8、胆道肿瘤、慢性肠炎、偏食、27月龄的新生儿以及长期服用广谱抗生素的患者等，由于VitK吸收或合成障碍，导致肝脏合成异常的凝血酶原、F、F、F等分子，PT延长。血循环中抗凝物质增加，如肝素或FDP增多等。DIC和原发性纤溶时，由于FDP生成增加，FDP有较强的抗凝能力，故使PT延长。用于香豆素类等口服抗凝剂的监控，一般认为以维持PT值在参考值的2倍左右（1.32.5倍）即2530s，或PTR为1.31.5（最大不超过2），INR为2.03.0为宜。 PT缩短见于口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。（4）注意事项：HCT影响：不同患者HCT不同，导致血浆量多少不一，因此游离的Ca2+浓度不同，从而
9、导致PT结果异常。对于HCT55%的患者，采血量或抗凝剂用量按下述公式计算。采血量（ml）=抗凝剂用量（ml）9（1- 0.45）（1-HCT）。血浆标本离心：相对离心力l500g、离心10分钟制备乏血小板血浆，若血浆中富含有血小板，PT将假性缩短。溶血、脂血标本：若溶血，由于红细胞中有促凝成分，可使PT假性缩短；脂血干扰某些仪器检测过程中的浊度变化，因此会引起PT检测结果的异常。2.活化部分凝血酶时间测定（APTT）（1）原理：37条件下，以白陶土激活因子和，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第三因子，在Ca2+参与下，观察乏血小板血浆凝固所需的时间，即为活化部份凝血活酶时间，是内源凝血系统
10、较敏感和常用的筛选试验。（2）参考值：男性：37s3.3s（31.543.5）s；女性：（37.52.8）（3243）s。受检者的测定值较正常对照延长超过10s以上才有病理意义。（3）临床意义：对内源凝血途径因子（、）缺乏较CT敏感（血小板异常不影响APTT），能检出：C小于25%的轻型血友病。对凝血酶原、纤维蛋白原缺乏则不够敏感，故APTT延长的最常见疾病为血友病。此时可进一步作纠正试验，即于患者血浆中加入l4量的正常新鲜血浆、硫酸钡吸附血浆或正常血清（试剂参见凝血酶原消耗试验的纠正试验），再作APTT，如正常血浆和吸附血浆能纠正延长的结果而血清不能纠正，则为因子缺乏；如吸附血浆不能纠正，其
11、余两者都能纠正，则为因子缺乏；如三者都不能纠正，则为病理性循环抗凝物质。在使用肝素治疗时，多用APTT监测药物用量，一般以维持结果为基础值的2倍左右（1.53.0倍）为宜（75100s之间）。但应事先检测所用部分凝血活酶试剂是否对肝素敏感，即向正常人血浆中加入不同量肝素（从每毫升0.11.0IU），看其APTT是否相应延长。血管性血友病：由于患者vWF缺陷，使F不稳定，导致F：C活性减低，故APTT延长。不同类型vWD F：C活性降低不一样，故APTT延长的程度也不同。异常抗凝物增多；血友病A患者长期输注F，可产生F抑制物，引起APTT延长。一些患者存在狼疮抗凝物（LAC），使APTT延长。纤
12、溶亢进：原发性和继发性纤溶亢进（如DIC），产生大量的FDP，使APTT延长。（4）注意事项：同PT。三、血管壁检验1.血管性血友病因子检测（vWF）：vWF是一种大分子蛋白多聚体。vWF的测定包括含量测定、功能分析，必要时还可进行基因诊断。（1）原理：vWF抗原测定：可利用免疫电泳法、ELISA或胶乳凝集散射比浊法进行准确定量。vWF瑞斯托霉素辅因子活性检测：在瑞斯托霉素存在的条件下，vWF通过与血小板膜GPb-相互作用使正常血小板发生凝集。凝集的强度与被检血浆中vWF的含量和结构有关。将正常人混合血浆作为100%瑞斯托霉素辅因子，用缓冲液将其稀释成不同稀释度，加入瑞斯托霉素和新鲜洗涤过的或
13、甲醛固定过的正常血小板悬液，血小板会出现不同强度的凝集。根据正常血浆的稀释度及其相应的凝集反应，绘制标准曲线。被检血浆的瑞斯托霉素辅因子活性可以从标准曲线中查到。（2）参考范围：vWF抗原 94.1%32.5%vWF瑞斯托霉素辅因子活性 50%l50%（3）临床意义：vWF减低：主要用于vWD的诊断和分型。vWF增高：vWF是一种急性时相反应蛋白，很多情况下都增高，常见于血栓性疾病、如心肌梗死等，肾小球疾病、DM、妊高征及大手术后。2.血浆6-酮-前列腺素Fl（6-Keto-PGFl）检测（1）原理：ELISA法：将抗原（6一酮-PGFl-牛血清白蛋白连接物）包被酶标反应板，加入受检血浆或6-
14、酮-PGFl标准品和一定量的抗6-酮-PGFl抗血清，作用一定时间后，再加入酶标记第二抗体，最后加入底物显色。标准品或受检血浆中的6-酮-PGFl与包被抗原竞争性的抗体结合，抗体与包被抗原结合的量与受检标准品或血浆中的6-酮-PGFl量呈负相关。根据标准曲线计算出受检血浆中6-酮-PGFl的含量。（2）参考值：（17.97.2）pgml。（3）临床意义：血浆6-酮-PGFl减低：见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤转移、肾小球病变、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。3.血浆血栓调节蛋白。（TM：Ag）的检测（1）原理：ELISA双抗夹心法：包
15、被抗TM单克隆抗体，待测血浆中TM与包被抗体结合，加入过氧化物酶标记的抗体，形成复合物，最后加入底物显色，颜色深浅与TM含量成正比。（2）参考范围：2552gL。（3）临床意义：正常情况下，血浆中TM水平很低，当血管内皮细胞损伤后，血浆TM水平显著升高，且与损伤程度相关。目前认为，血浆TM检测是了解血管内皮细胞损伤的最好的指标。血浆TM水平增高见于糖尿病、SLE、DIC、急性心肌梗死、TTP、HUS、脑血栓、白血病等。 四、血小板检验1.血小板生存时间（PST）（1）原理：丙二醛（MDA）法或TXB2法：由于阿司匹林能不可逆性抑制血小板AA代谢过程中环氧酶的活性，使其代谢产物MDA和TXB2生成减少。与此同时，因新生血小板未受阿司匹林的抑制，故其MDA和TXB2含量正常。根据病人口服阿司匹林后，血小板MDA和TXB2生成量的恢复曲线可推算出血小板的生存时间。MDA含量可用荧光分光光度计法测定，TXB2可以用放射免疫法或酶免测定。本试验可反映血小板生成与破坏之间的平衡，但在血小板计数过低时本法的敏感性较差。（2）参考值：MDA法：10.84.2天；TXB2法：9.31.7天。（3）临床意义：血小板生存期缩短，见于：血小板破坏增多性疾病：如原发性血小板减少性紫癜、同种和药物免疫性血小板减少性紫癜
