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1、pcDNA3.1-GFP转染细胞实验.cn2023年08月07日 09时21分55秒来源：未知浏览：286次【原理】 外源基因进入细胞重要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，事实上其基本原理都是运用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都运用脂质体。运用脂质体转染和其他方法同样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与治理的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外
2、源质粒进入细胞的一般过程。本实验学习和掌握外源基因导入真核细胞的重要方法 脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白）。【试剂与仪器】 1 小牛血清。2 双抗溶液（链霉素 100g+ 青霉素 100 单位）。3 DMEM 培养基。4 转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2023 ）。5 细胞培养基（ DMEM+10%NCS ）。6 PBS 。7 无血清培养基。8 胰酶（ Trypsin ）。9 培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和 CCD 。【操作环节】 1 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使
3、其在转染日密度为 90% 。细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中（参见表 6 了解建议的细胞密度）。2. 对于每孔细胞，使用 50l 无血清 DMEM 培养基稀释 0.8g-1.0g DNA 。多孔操作可以批量制备。3. 对于每孔细胞，使用 50l DMEM 培养基稀释 1l-3l LIPOFECTAMINE 2023 试剂。 LIPOFECTAMINE 2023 稀释后，在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会减少活性。4. 混合稀释的 DNA （由第 2 步）和稀释的 LIPOFECTAMINE 2023 （由第 3 步）。在室温保温 20 分钟。注意
4、：溶液也许会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：假如在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为 0.5ml 无血清培养基。6. 在 37 ， 5 的 CO 2 中保温 24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会减少转染活性。7. 在细胞中加入复合物 24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选
5、抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。（编辑：无城） 查看所有评论发表评论 评价: 中立 好评 差评 本文来自: G 基因时代,生物protocol,为生命科学提供源动力！具体出处参考：真核表达载体 pcDNA3.1-GFP 的构建.cn2023年08月07日 09时21分27秒来源：未知浏览：634次【原理】 引物中设计入限制酶位点：由于 PCR 引物的 5 末端可以增长一些非 互补碱基，因此可以在两引物的 5 末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的 PCR 产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体 DNA 重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计 不同酶切位点时，可有
6、效地定向克隆 PCR 产物。其缺陷是需要加长 PCR 引物，除限制酶辨认序列外，还需要在其 5 端多合成 23 个碱基 以利于限制性内切酶与 PCR 产物末端的稳定结合。本实验用内切酶将 T-GFP 质粒的 GFPcDNA 切割下来，与用同样内切酶消化的 pcDNA3.1 连接，构建真核表达载体 pcDNA3.1-GFP 。【试剂】 1 菌种 含绿色荧光蛋白重组子 T-GFP 质粒2 LB 液体培养基 称取胰蛋白胨 3.0g ，酵母提取物 1.5g ， NaCl 3.0g ，加双蒸水 200ml 溶解，用 5mol/L NaOH 调至 pH7.4 ，定容至 300ml ，转移至三角烧瓶中，以
7、103.4Kpa 高压灭菌 20min 。3 10mg/ml 氨苄青霉素 (Amp) 溶液 在无菌条件下配制， 20 贮存备用。4 含 Amp 的 LB 固体培养基 每 100ml LB 培养液在临高压灭菌前加入 1.5g 琼脂，以 103.4KPa 高压灭菌 20min ，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液也许过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至 50( 用手背碰一下瓶壁不致烫手 ) ，方可加入 Amp ，按每 100ml 培养基加 10mg/ml Amp 溶液 1ml ，使其终浓度为 100g/ml ，然后在超净台上
8、铺平板， 90mm 直径的培养皿约需 25ml 培养基。5 Tris-HCl 饱和酚 (pH8.0) 。6 溶液 含 50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na 2 ， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ，临用前加溶菌酶至 2mg/ml 。7 溶液 含 200mmol/L NaOH ， 10g/L SDS ，临用前用两种溶液的贮存液配制。8 溶液 5mol/L 醋酸钾溶液 60ml( 称取 29.4g 醋酸钾定容至 60ml) ，冰醋酸 11.5ml 和双蒸水 28.5ml 混合而成。9 10mg/ml RNase A 称取 RNase A 10mg 溶于 1
9、0mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 、 15mmol/L NaCl 中，于 100 加热煮沸 15min 灭活 DNase ，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于 20 。如为 Sigma 公司产品，一般则不需加热煮沸。10 TE 缓冲液 (pH8.0) 含 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ， 1mmol/L EDTA-Na 2 (pH8.0) ，以 103.4Kpa 高压蒸汽灭菌， 4 贮存。11 限制性内切酶 Eco R 及其缓冲液 只需购买国内试剂公司的产品即可，每种 RE 均配有 2 种缓冲液，在配套的缓冲液中该 RE 均可获得 100% 酶切活性。12 50
10、TAE 电泳缓冲液 取 Tris24.2g ，冰醋酸 5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至 100ml 。 1TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。13 溴酚蓝指示剂溶液 (6 上样缓冲液 ) 称取溴酚蓝 100mg ，加双蒸水 5ml ，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖 25g ，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50ml ，加入 NaOH 1 滴，调至蓝色。14 溴化乙锭 (EB ， 1 mg/ml) 戴手套谨慎称取 EB 20mg 于棕色试剂瓶中，加 20ml 双蒸水，溶解后贮于 4 备用，配制琼脂糖凝胶时每 100ml
11、凝胶加 50l EB 。15 DNA 分子量标准 根据需要购买，一般浓度为 0.5g/l 。16 其他试剂 氯仿、异丙醇、无水乙醇。【操作环节】 1 将下列试剂 缓冲液 2l ， T-GFP 质粒或 pcDNA3.1 质粒 (1g) ， Kpn I 和 Apa I 各 5 10U 加至 0.5ml EP 管中，加双蒸水至 20l ，加盖，混匀后稍离心， 37 水浴反映 1h 。2 琼脂糖凝胶电泳 在进行酶切时预先灌好 . 称取 1g 琼脂糖，加 2ml 50TAE 电泳 Buffer 和 98ml 蒸馏水，在电炉或微波炉上溶解，配制成 1% 琼脂糖凝胶 100ml ，稍冷后，加 5l 10 m
12、g/ml EB ，混匀 . 安装好电泳槽和样品梳，灌胶。3 上样 在电泳槽内盛放 1TAE ，撕去制胶托架两端的封胶，将制胶托架装入电泳槽内，小心取出样品梳 . 取 PCR 样品 10l ，加 2l 6 载样 buffer 在 Parafilm 膜上混匀，上样。4 电泳 对的连接电极，在 100V 恒压条件进行电泳，待蓝色染料泳过 2/3 段凝胶，停止电泳。5 取出凝胶，在紫外分析仪上观测结果，分析判断酶切产物的大小。6 将 730bp 的 GFPcDNA 和 5.4kb 的线性 pcDNA3.1 切胶回收（参见实验三环节 9 ）。用连接酶将 GFPcDNA 片段与线性的 pcDNA3.1 载
13、体连接。在 0.2ml 或 0.5ml 反映管中加入下列成分pcDNA3.1 50ngGFPcDNA 100ngT4 连接酶 2-3 weiss units10 连接缓冲液 1l补超纯水至总体积为 10l ，常温下放置 30 分钟以上；也可以 16 或 4 过夜。7 重组子的转化在无菌条件下按每管取 100l 新鲜感受态细菌置于无菌的 1.5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入连接产物和消毒水 ( 作阴性对照 ) 各 5l ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min 。 42 ，热休克 90s ，半途不要摇动离心管，每管加 800l 无抗生素的 LB 培养基，于 37 空气摇床中以 1
14、50 r/min 速度振摇 45min ，使细菌复苏。每管取 200l 加至含氨苄青霉素（ Amp ）的 LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置 20min ，使液体吸取，然后 37 倒置培养 12 16h 至单菌落形成。8 提取质粒 , 酶切鉴定的阳性重组子 , 命名为 pcDNA3.1-GFP ?（编辑：无城） 本文来自: G 基因时代,生物protocol,为生命科学提供源动力！具体出处参考：http:/ 质粒 DNA 介导的基因表达克制 在 6 孔培养板，不含抗生素的胎牛血清生长培养基中生长细胞至 5070% 贴壁。 注意：这一实验流程合用于 6 孔培养板。如用其它尺寸培养板请按适当比例调整试剂量。注意：健康和亚成簇细胞是转染成功的关键。建议在转感前一天拟定细胞活性。准备如下液体：注意：最佳的 shRNA 质粒 DNA: shiRNA 质粒转染试剂比例应当根据经验而定。1 g shRNA质粒 DNA 比 1.0 到 6.0 l shRNA 质粒转染试剂。当针对某一细胞株的 shRNA 质粒 DNA: shiRNA 质粒转染试剂比例拟定后，应进一步拟定每孔 shRNA 质粒 DNA: shRNA 转染试剂混合物的适当用量。此量为能产生最高转染效率的用量。例如：假如最佳 shRNA 质粒 DNA: sh
