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1、浅论人端粒酶启动子（hTERTp）真核表达载体的构建【摘要】 目的 克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，构建真核表达载体 pEGFP-hTERT。方法 以人类基因组DNA为模板，应用 PCR方法扩增hTERT 上游序列长约1 135 bp的启动子片段，克隆入绿色荧光蛋白GFP的基因上游，测序鉴定。结果 DNA测序结果与 GenBank中 hTERT启动子 DNA 序列完全一致，片段长度为1 135 bp。结论 人端粒酶启动子的真核表达载体pEGFP-hTERT构建成功，为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗奠定了基础。【关键词】 端粒酶启动子；荧光蛋白；肿瘤 Abstract：
2、Objective To clone DNA sequence of human telomerase reverse transcriptase promoter (hTERTp) , and to construct eukaryotic expression plasmid of pEGFP- hTERT. Methods 1 135 bp hTERT promoter were amplified with polymerase chain reaction (PCR) method, utilizing human genome as template. The hTERT prom
3、oter was inserted into pEGFP to reconstruct a recombinant plasmid named pEGFP-hTERTp, and the sequence was detected. Results DNA sequencing showed a same sequence as registered in Gene Bank. The sequence contained 1 135 bp. Conclusions The construction and the expression of eukaryotic plasmid pEGFP-
4、hTERTp have been achieved successfully. The research paved the way for tumor gene therapy of regulatory elements of hTERTp. Key words:hTERTp; GFP; cancer 端粒酶由RNA和蛋白质两部分组成。以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。端粒酶具有使肿瘤细胞系持续复制生存的特点，成
5、为近期生命科学界关心与研究的一个热点。端粒缺陷的染色体不稳定性使其通过促进半合子化、转位、扩增及重组装而加速肿瘤进程。端粒磨耗的最终结果是端粒酶的活化，以弥补端粒的丢失而使细胞无限增殖，成为永生细胞。端粒酶活化使肿瘤进入晚期，而启动子的激活是细胞永生的关键一步，因此端粒酶的启动子(human telomerase reverse transcriptase promoter, hTERTp)已经逐渐成为学者们研究的焦点。本实验中，我们采用 PCR 方法克隆了 hTERTp 的DNA序列 ,并将其替换绿色荧光蛋白质粒 pEGFP-N1上游的启动子,以便为研究以 hTERTp为靶点的肿瘤靶向性基因
6、治疗奠定基础。 1 材料和方法 细菌和质粒 大肠杆菌DH5购买于Takara公司；荧光蛋白质粒pEGFP-N1购买于Promega公司。主要试剂和实验设备 DMEM 培养基为 GIBCO 公司产品;质粒小量提取纯化试盒、kbMarker、 PCR产物纯化试剂盒为北京威格拉斯技术有限公司产品；PCR引物由大连宝生物有限公司合成；限制性内切酶Ase、BamH、Taq聚合酶、DNA 连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.为TaKaRa 公司产品；LipofectamineTM 2 000、Trizol购买于Invitrogen 公司；主要实验设备有:Biometra personal公
7、司生产的 PX2 型96孔 PCR 扩增仪,Bio-RAD 公司生产的 PCA300 型电泳仪。主要试验步骤hTERTp的PCR扩增及鉴定 根据 GenBank中hTERT序列设计两对引物。DLM1：上游引物5-GCACCCATAATACTGGGGTGTCTTC-3, 下游引物5-CGCGCTCGCACAGCCTCTG-3；DLM2：上游引物:5-TAATTAATCTGTCCTGCGGTTGTGCCG G-3下游引物:5-CGGGATCCGAGCGCACGGCTCGGCAG-3；DLM2引物5端分别引入限制性内切酶Ase、BamH的酶切位点(下划线表示)。先以基因组为模板，以DLM1为引物，退
8、火进行PCR反应，扩增产物为2 068 bp；再以第一次PCR产物为模板，以DLM2为引物,退火66进行PCR反应，扩增目的片段为1 135 bp。PCR产物用%琼脂糖凝胶( TAE缓冲液配制)电泳 ,并用PCR产物回收试剂盒回收纯化1。pEGFP-hTERTp重组质粒的构建 用Ase和BamH双酶切带酶切位点的PCR产物，用 PCR 产物纯化试剂盒回收约 1 135 bp的 DNA 条带；用Ase和BamH双酶切pEGFP-N1质粒，酶切产物用%琼脂糖凝胶电泳回收；上述两种回收产物按质量比为41作连接反应，采用 Ligation KitDNA 连接试剂盒，16过夜。将连接反应液转化感受态大肠
9、杆菌DH5，涂布于含50 mg/L卡那青霉素的LB 琼脂板，倒置于37 恒温箱中过夜培养，次日挑单菌落，接种于10 mL含50 mg/ L卡那青霉素的 LB 培养基中，37振荡培养过夜。取 5 mL 菌液，用质粒纯化试剂盒制备少量质粒，用 Ase和BamH双酶切和PCR两种方法鉴定，并取含pEGFP-hTERTp的菌液1 mL送上海生工做DNA序列分析。 田力，等：人端粒酶启动子真核表达载体的构建辽宁医学院学报 2008年12月，29(6) 2 结 果 PCR产物电泳结果 以人类基因组为模板, PCR 扩增 hTERTp，经 %琼脂糖凝胶电泳，得到清晰的1 135 bp大小的 DNA 片段(图
10、1)，与预期结果吻合。M：Marker 1：PCR产物真核表达载体的鉴定 PCR 产物或酶切产物分别取 5 L 与 6 Loading Buffer 1 L 混匀上样，进行%琼脂糖凝胶电泳。PCR鉴定 以pEGFP-hTERTp质粒为模板的 PCR产物预期产生1 135 bp 条带，而电泳结果与预期相符，见图2。酶切鉴定 pEGFP-hTERTp经Ase和BamH双酶切预期产生1 135 bp和 3 986 bp 两条带，见图3，说明该质粒经酶切鉴定正确。M：Marker 1：质粒PCR结果测序鉴定 构建的hTERTp序列与hTERTp原始序列(AF098956)进行比对，测序结果说明表达载体
11、构建成功。3 讨 论 GFP是从水母中分离出来的一种发光蛋白，它可在450490 nm的蓝光激发下发出绿光。而 GFP 作为一种基因表达的标记物其优点在于：携带 GFP 的融合蛋白既具有 GFP的绿色荧光，又保持靶蛋白的生理功能，而且对细胞无毒性作用；将 GFP融合基因转染至真核细胞中表达后，分析已知或未知基因表达蛋白在细胞中的分布和定位。因此，GFP 作为一种极具有潜力的标记物为研究基因功能及表达调控提供了极大的便利。 端粒酶(telomerase)是一种RNA依赖的DNA多聚酶，其功能是以自身的RNA为模板，合成位于染色体末端的一段富含 5 -TTAGGG -3 的特殊 DNA 序列,即端
12、粒，补偿细胞分裂过程中端粒的丢失，使细胞得以无限分裂。端粒酶激活是细胞获得永生化和恶性变的重要机制。有研究显示，端粒酶在85%以上的肿瘤细胞中呈现阳性表达，而在几乎所有的正常人体细胞中无活性。这一现象提示，hTERT基因表达的调控是端粒酶活性调控的中心环节，hTERTp在肿瘤细胞中的特异性转录使人们意识到hTERTp在肿瘤细胞中的激活也是肿瘤发生的关键因素。研究表明，转录起始位点位于hTERT cDNA首位核苷酸上游-19 bp，在hTERTp区域没有TATA盒和CAAT盒，但是包含转录起始元件CCTCTCC，因此，称转录起始位点上游180208 bp为核心启动子区，神经酰胺能够阻断该核心区，
13、而抑制hTERTp的功能2。但是，hTERTp具体哪一部分序列是启动基因转录的必需元件目前还在探索中。 近年来，一些学者在这方面作了一些探索。李帆等人通过PCR的方法获得了335 bp长度的启动子，并证明它能够启动LacZ基因的表达3。王艳等人通过人工合成的方法获得了258 bp hTERTp，启动了 黑色素瘤分化相关基因-7的表达4。采用 PCR方法克隆了长度为1 135 bp的hTERTp片段，位于转录起始位点上游1 135 bp到起始密码子之间，我们将克隆的 hTERTp插入到绿色荧光蛋白GFP 基因上游，PCR结果与测序结果均证明重组质粒pEGFP-hTERTp构建成功。下一步我们将通
14、过PCR的方法利用已经构建成功的重组质粒pEGFP-hTERTp获得250 bp、500 bp、800 bp、1 135 bp等不同长度的启动子再插入到绿色荧光蛋白GFP 基因上游，观察它们是否具有启动绿色荧光蛋白GFP 基因表达的活性，确定hTERTp的具体启动必需序列的位置，从而为调控hTERTp在肿瘤细胞中的表达的研究奠定基础。应用hTERTp驱动肿瘤相关因子凋亡或表达增强，可以获得对癌细胞生长明显的抑制和诱导凋亡的作用5，也为研究hTERTp功能和为临床基因治疗肿瘤提供了新的思路。 【参考文献】 1 Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆实验指南M
15、.北京:科学出版社 ,1996 :486-491. 2 Leslie G Wooten-Blanks,Pengfei Song,Can E Senkal，etof ceramide-mediated repression of the human telomerase reverse transcriptase promoter via deacetylation of Sp3 by histone deacetylase 1J.2007，21:3386-3397.3 李帆，谭晓华，彭晓君，等.人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究J.第一军医大学学报，2005，25：207-211.4 王艳，浦颖艳，方琳，等.MDA2 7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响J.江苏大学学报，2008，18：205-208.5 张明，辛晓燕，李红梅，等.hTERT启动子驱动的 TRAI L诱导宫颈癌细胞的凋亡作用J.细胞与分子免疫学杂志，2007，23：638-640.
