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1、基因工程：诞生于20 世纪 70 年代。概念：实在分子水平上进行的操作，指将多种生物体（供 体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，严密的设计，经过体 外加工重组，转移到另一种生物体（受体）细胞中，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传 性状的技术。三要素：供体 受体 载体。基因工程的主要内容：1.目的基因的获取 2.重组体的制备 3.重组体的转化 4、克隆鉴定 5、 目的基因的表达限制性内切酶：是一种能够识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列（4-8bp）并由此处切 割双链的核酸内切酶。 1、来源：原核生物 2、性质：在核酸分子链的内部制造切口3、功 能：自身保护作用（R/
2、M体系：保护自身的DNA不受限制，破坏外源的DNA使之迅速讲 解）影响限制酶活性的主要因素：1、DNA的纯度2、DNA的甲基化程度3、温度4、缓冲溶 液 5、 DNA 的分子结构Klenow片段：E.coli DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端 605个氨基酸残基片段。该片段保留了 DNA聚合酶I的5 -3 聚合酶和3 -5 外切酶活 性，但缺少完整酶的5 -3 外切酶活性。 功能：1、3 断的补平；2、DNA 3 末端标记； 3、cDNA第二链的合成。平齐末端 DNA 的连接方法：1、同聚物加尾法 2、衔接物法； 3、接头连接发。 双酶切相对单酶切的优点：可保证插入
3、外源片段的方向，防止载体自连，提高重组率。 星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象 称星号活性。部分酶切：指选用的核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 发生部分酶切的原因：底物DNA纯度低；识别序列甲基化；酶用量不足；反应缓冲液和温 度不适宜。碱性磷酸酶和S1磷酸酶的功能：碱性磷酸酶主要是脱磷酸作用，其产物具有5-OH末端， 这种功能使它在DNA分子克隆实验中发挥着重要作用，利用该酶可以有效防止粘性末端 分子自连。S1核酸酶：是一种高度单链特异的核酸内切酶，可降解单链DNA或RNA，不仅能催化RNA 和单链DNA分子降解成为5单
4、核苷酸，而且它也能作用于双链核苷酸单链区。功能：测 定杂种核酸分子的杂交程度，给RNA分子定位，测定真核生物基因中间隔子序列的位置， 探测双螺旋的DNA区域，从限制性内切酶产生的粘性末端中移去单位链突出序列以及打 开双链cDNA合成期间形成的发夹结构。载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 基因工程对载体的要求： 1、在宿主细胞能独立复制 2、有选择性标记 3、有一段多克隆位 点 4、分子量小、拷贝数多 5、容易从宿主细胞中分离纯化质粒载体必须具备的条件： 1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因 3、若干限制酶的单 一位点 4、具有较小的分子量和较高的拷贝
5、数质粒的分离：通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌的裂解。1、氯化 铯密度梯度离心法 2、碱变性法 3、微量碱变性法质粒载体的基本构型：1、共价闭合环状DNA 2、开环DNA 3、线性DNA 表达型质粒载体：主要使外源基因表达出蛋白质产物，如果在大肠杆菌里表达，必须使所克 隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录和翻译之下。穿梭质粒载体：人工构建的具有两种不同重复起点和选择标记，可以在两种不同的寄主细胞 中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌表达载体的操纵元件：阻遏基因I ,操纵基因O,启动基因P,核糖体结合位序列， 转录终止信号。质粒载体不稳定的因素：1、结构的不稳定性：DNA的插入
6、，缺失和重排都会造成质粒载 体结构不稳定。2、分离的不稳定:在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒 拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。影响质粒载体稳定性的主要因素：1、新陈代谢负荷a、复制负荷b、转录和翻译负荷2、 质粒载体的拷贝数 3、寄主菌的重组体系PCR的原理和特点：原理：类似于DNA的体内复制，首先待扩增DNA模板加热变性解链， 随之将反应混合冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升 高，使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸，这种变性、复性、延伸的过程，就是一 个 PCR 循环， PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。特点：1、灵敏度高 2
7、、简 便快捷 3、对标本的纯度要求低反向PCR:是用反向互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的 位置序列进行扩增。RT-PCR是以反转录的cDNA做模板进行的PCR反应，用于测定基因表达的强度和鉴定 已知序列是否发生突变，呈现mRNA多态性，克隆mRNA 5 和3 末端序列，以及从非 常少量的 mRNA 样品构建大容量的 cDNA 文库。多重PCR:在一个反应体系中，使用一对以上引物的PCR反应，称为多重PCR。荧光定量PCR：通过荧光染料火荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时 在线监控反应过程，结合相应的软件，可以对结果进行分析、计算待测样品的初始模
8、板量。引物设计的基本原则：1、引物一般在18-30Bp为宜。2、避免引物内部出现出现二级结构、 回文结构。3、GC和AT碱基均匀分布4、避免出现两引物碱基末端互补5、引物3 末端碱基一般应与 DNA 严格配对 6、引物碱基序列不能与非扩增区有同源性。PCR产物不正常的原因：1、没有PCR产物a/TAQ酶失活b、引物使用错误c、是否完全解 链。2、没有特异性条带a/退火温度过低，退货延伸时间过长b/循环次数过多c/引物与 TAQ酶的浓度过高d/Mg离子浓度过高3、没有目的条带，出现片状。a/循环次数过多 b/TAQ酶浓度过高c、引物特异性不强d/Mg离子浓度过高目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。基因文库：
