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1、实验六 阿托品拮抗豚鼠回肠M受体的pA2测定 实验目的 1. 通过实验了解离体平滑肌基本实验方法； 2. 观察阿托品对豚鼠回肠M受体竞争性拮抗作用。实验动物 豚鼠，体重300g左右，雄性。实验药品 1.乙酰胆碱（2*10-5,2*10-4,2*10-3,2*10-2，2*10-1,2mol/L） 2.阿托品 （5*10-5,5*10-4,5*10-3mol/L） 3.台氏液实验器材 100ul微量注射器、培养皿、眼科镊、持针器、缝针、缝线、洗瓶、吸管、肌力换能器、HSS-1(B)型恒温浴槽、RM6240生物信号采集处理系统。实验方法1. 仪器安装调试：（1） 搭建好仪器后，打开水浴锅电源，使浴
2、槽温度保持在37，清洗水浴槽后，加入台氏液20ml，通气，使气泡呈碎花状释放；（2） 启动计算机，双击RM6240生物信号采集处理系统，打开“阿托品拮抗豚鼠回肠M受体的pA2测定”，设置好实验参数，使软件处于示波状态。2. 标本准备：取豚鼠回肠22.5cm，（制备详见附录），用丝线将肠管对角结扎（不要封闭肠腔），一端固定在浴槽的通气钩上，另一端垂直连接于肌力换能器的感应片上，调节基础张力约为0.5g。肠管在槽内稳定15min后，记录正常收缩活动。3. 观察项目：（1） 未加阿托品时每个ACh累集浓度引起的肠管最大收缩幅度；（2） 分别加入阿托品（3个浓度）后，每个ACh累加浓度引起的肠管最大收
3、缩幅度。4. 给药方案：（1） 用微量注射器或微量加样枪像麦氏浴槽内从低到高加入ACh以累加摩尔浓度（mol/L）递增，当每个浓度引起肠管收缩反应达到最大时，立即累加另一个浓度，直到收缩反应不再增加，即达最大反应，制作ACh量效曲线；（2） 用台氏液冲洗标本35次，稳定10min后，加入5*10-5mol/L的阿托品20ul，使其终浓度为5*10-8mol/L，重复步骤（1）；（3） 上述离体回肠经冲洗恢复正常后，加入5*10-4mol/L的阿托品20ul，使其终浓度为5*10-7mol/L，重复步骤（1）；（4） 上述离体回肠经冲洗恢复正常后，加入5*10-3mol/L的阿托品20ul，使其
4、终浓度为5*10-6mol/L，重复步骤（1）。5. 数据处理（1） 数据保存实验结束，点击“停止示波”，保存文件，对文件进行编辑，选择预览键删除不需要的页面，注意应另外备份一份原始数据以防编辑时发生错误而丢失数据。使用“反演”键选择适当的记录进行编辑，若太长，可调节通道右侧“扫描速度”键，将波形压密。点击“分析”栏，选择“区域测量”，测量每个ACh累计浓度下肠管收缩引起基线上移的累积高度。所得结果列于表中，以ACh引起最大收缩高度为分母，求每个ACh浓度下收缩高度与最大收缩高度的比值E/EMAX。在“文件”栏中选择“打印模式设计”栏的“当前整体打印”、“学生实验”；“实验”栏的“实验信息”，
5、输入院系（姓名）、班级和学号，编辑完成后，使用“预览打印”进行检查，确认无问题后打印结果。（2） 结果处理A 绘制乙酰胆碱累积量效关系曲线：以乙酰胆碱引起的最大收缩幅度为100%，计算加入不同剂量乙酰胆碱后的张力变化百分率填入表一，并以此为纵坐标，以乙酰胆碱的摩尔浓度为横坐标，作图画出量效曲线，并求出每条ACh量效曲线的EC50；根据改良的Linewaver-Burk公式可知C/E=KD/Emax+1/EmaxC.(1)以ACh浓度C为X，以每个ACh浓度与其引起收缩强度的比值c/E为Y，进行直线回归，求出每条ACh量效曲线的直线回归方程Y=a+bX根据公式（1）可知，a/b=KD/Emax*
6、Emax=KD（此处KD相当于EC50，由此可得在阿托品浓度为0、5*10-8、5*10-7、5*10-6mol/L的ACh量效曲线的EC50值分别为EC50a, EC50b, EC50c, EC50d。B 求出每个阿托品浓度下的AChEC50 与无阿托品时AChEC50的比值。X1= EC50b /EC50a, X2= EC50c /EC50a, X3= EC50d/EC50a C.找出阿托品的PA2 根据Schild方程 PAX=-lgB-lg(Xi-1) 当X=2时，lg(Xi-1)=0, 此时-lgB=PA2 因此可用Schild作图法求PA2,比单点法更准确：以lg(Xi-1)为纵坐
7、标，阿托品浓度负对数-lgB为横坐标作图，将每个-lgB对应的lg(Xi-1)值的连线与横轴的交点即为PA2值。表一 乙酰胆碱累积给药及张力变化Ach浓度 加药量 Ach终浓度 负对数 加入阿托品后张力变化E/Emax(%)（mol/L） ul （mol/L） （-log） 0 5*10-8 5*10-7 5*10-62*10-5 10 10-8 8 21.3 50.0 26.4 19.3 20 3* 10-8 7.5 28.2 49.1 29.7 19.1 70 10-7 7 46.6 53.0 29.0 17.72*10-4 20 3*10-7 6.5 52.1 53.3 28.7 17.
8、0 70 10-6 6 61.4 50.8 24.4 13.92*10-3 20 3* 10-6 5.5 61.7 48.9 21.2 12.0 70 10-5 5 73.3 46.4 19.0 11.82*10-2 20 3*10-5 4.5 75.1 57.4 18.2 11.8 70 10-4 4 90.5 70.3 28.5 12.42*10-1 20 3* 10-4 3.5 100 69.1 33.3 12.7 70 10-3 3 99.4 73.6 34.9 23.12 20 3*10-3 2.5 100 90.8 81.0 57.2图一 阿托品对Ach量效曲线影响根据公式 C/E
9、=KD/Emax+1/EmaxC，进行直线回归，得到下表表二直线回归方程项目直线回归方程R乙酰胆碱Y= 0.2966X + 9E-061阿托品浓度1+乙酰胆碱Y= 0.3315X + 9E-050.9942阿托品浓度2+乙酰胆碱Y= 0.3929X + 0.00050.8602阿托品浓度3+乙酰胆碱Y= 0.5616X + 0.00120.7938根据 a/b=KD/Emax*Emax=KD，KD相当于EC50,由此得到四个EC50值： EC50a=3*10-5 EC50b=2.7*10-4 EC50c=1.3*103 EC50d=2.1*10-3求出每个阿托品浓度下的AChEC50 与无阿托
10、品时AChEC50的比值: X1= EC50b /EC50a=8.95 X2= EC50c /EC50a=41.94 X3= EC50d/EC50a=70.42根据 Schild方程 PAX=-lgB-lg(Xi-1) 作图求pA2：图二Schild方程求pA2所以：pA2=8.1363/1.9536=4.165 实验讨论由公式：药物效应E=A/(A+KD)*Emax*a可知：1、 a=1 表示有较强的内在活性，为受体的完全激动剂；2、 0a1表示无内在活性不强，为部分激动剂；3、 a=0 则表示无内在活性，与受体结合其拮抗激动剂的作用乙酰胆碱能够作用于回肠平滑肌M3受体，引起平滑肌收缩，在肌
11、力换能器上就表现为回肠的张力增大。当加入M受体拮抗剂阿托品后，若提高乙酰胆碱浓度，仍能达到未加拮抗剂前的最大反应，在以乙酰胆碱的摩尔浓度的负对数为横坐标，以张力变化百分率为纵坐标的量效曲线中则表示为量效曲线平行左移，表明阿托品对乙酰胆碱呈竞争性拮抗。pA2是一种用以表示竞争性拮抗剂作用强度的指标，其意义是能使激动剂提高到原来的2倍时，产生与原来浓度相同效应所需的拮抗剂克分子浓度的负对数。pA2的值越大，说明拮抗剂的作用越强。实验结论阿托品为乙酰胆碱的竞争性拮抗剂，在豚鼠的回肠M受体实验中其拮抗参数pA2为4.165注意事项 1. 豚鼠实验前应该禁食8h； 2. 肠管不能贴壁，气泡不要直接冲击肠管； 3. 药液要直接加入浴槽内台氏液中，不要滴在吊线或者管壁上，加药同时要立即标记。
