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1、 壳聚糖-银配合物的制备及其抗菌性能研究生物与化学工程系 应用化学专业118652008026 林季琳 指导老师 薛丽群【摘要】本文用壳聚糖与硝酸银反应，制备了壳聚糖-银配合物，探讨了配比、温度、反应时间和pH等条件对配 合物形成的影响，通过红外光谱对配合物进行结构分析表征。研究了壳聚糖-银配合物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抑菌性能。结果表明，以壳聚糖对银离子的吸附量为指标，在本实验条件下制备壳聚糖-银配合物的较适宜条件为：0.100g壳聚糖中加入25.00mL 0.02mol/L AgNO3，反应温度为50，反应时间为6h，pH值为3。抗菌实验结果表明，用浓度为2mg/mL的壳聚糖
2、-银配合物对大肠杆菌、白色念珠菌和枯草芽孢杆菌均可达到80%左右的抑菌率。【关键词】壳聚糖；Ag（）离子；配合物；抑菌1.前言自然界中，许多微生物是人类及动植物众多疾病的病原体，它们时刻威胁着人类的生存与发展。2003年的SARS病毒全国大面积感染事件，2009年在墨西哥引发的“H1N1”流感并感染人致死等事件，这一切都给人们留下了许多思考，公共卫生已引起了各国政府和世界人民的高度关注。为了人类自身的健康发展，改善个人卫生条件已经成为人们的共识。研制高效的抗菌剂对人们健康水平的提高具有十分重要的意义。抗菌剂一般包括无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂三种1。无机抗菌剂主要是利用无机离子(如银、铜
3、、锌、钛等)或无机抗菌氧化物来实现杀菌或抑菌的一类抗菌剂。有机抗菌剂主要成分可分为醇系、酚系、醛系、酯系、醚系、过氧化物系、环氧化物系、卤素系等。天然抗菌剂主要是天然动、植物的一些提取物，如鱼腥草素、壳聚糖等，人类最早使用的是天然抗菌剂。甲壳素是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖，其学名是-(1，4) -2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖以-1，4 糖苷键缩合而成的。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，一般而言，N-乙酰基脱去55%以上的就可称之为壳聚糖，或者说能在1%乙酸或者1%盐酸中溶解1%的脱乙酰甲壳素，这种脱乙酰甲壳素就被称之为壳聚糖2，结构如图1所示。 图
4、1.壳聚糖的结构壳聚糖是一种天然抗菌剂，而且是一种环境友好材料，无毒、无味、可生物降解。其主要原料来源于水产加工厂废弃的虾壳和蟹壳。壳聚糖呈白色或淡黄色半透明状固体，略有珍珠光泽。它具有良好的化学物理性能，能拉丝、成膜、制粒。因为壳聚糖分子链上有活性基团，如氨基和羟基，可修饰活化偶联生成各种衍生物，化学修饰包括羟甲基化、羟基化、烷基化、酰基化、硫酸酯化、缩合反应、接枝与交联反应等。通过化学修饰作用，在壳聚糖分子结构中引入了各种功能团，改善其物化性质。壳聚糖还表现出了止血活性、抗微生物活性、以及与金属离子的强亲和性3,4，在食品、制造、化工、环境保护等方面中的运用受到很大的重视。壳聚糖及其衍生物
5、抗菌活性的基础研究受到了广大科研学者的关注。黎碧娜等5对磺化壳聚糖的抑菌性能进行了研究，认为磺化壳聚糖对大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、黑曲霉、假丝酵母都有抑制作用，并且磺化壳聚糖浓度越高，抑菌效果越好。王勇等6将壳聚糖经100Gy60Co 射线辐射处理后，发现其对金黄色葡萄球菌抑菌效果最强。Guo等7合成了不同分子质量的壳聚糖季铵盐，对番茄灰霉病和炭疽病的抗菌效果进行测定发现，壳聚糖季铵盐比壳聚糖具有更强的抗菌性，而且高分子质量的壳聚糖季铵盐的抗菌性强于低分子质量的壳聚糖季铵盐。研究结果表明壳聚糖及其衍生物的抗菌效果明显，衍生物的抗菌性研究空间更大。作为天然抗菌剂的壳聚糖在自然界中含量丰富，杀
6、菌速度快、抑菌效果好，而且具有良好的物理、化学性能和生物相容性，但耐热性能差，大大限制了其应用范围8，9。而无机系抗菌材料中以Ag+效果最好，但是与天然或人工合成的高分子化合物亲和性、相容性较差，并且价格昂贵。壳聚糖中糖元的2位为NHCOCH3或游离的NH2，3位为仲OH和6位为伯OH，这种特殊的结构使得壳聚糖对一些金属离子在一定的pH值下具有螯合作用10。赵玉清等11人合成了壳聚糖Ag(I)，并对其抑菌性研究认为，壳聚糖银对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用，并且抑菌性能力随配合物中Ag的配位比的增大而增强。本实验将制备壳聚糖-银配合物，将天然抗菌剂与无机抗菌剂进行复配。利用壳聚糖-银具有创口愈
7、合和抑菌两种特性，研究该配合物对大肠杆菌、白色念珠菌和枯草杆菌的抑菌性能。希望可以找到壳聚糖与Ag最佳的配比，并且得到的产物对这三种常见的菌有明显的抑菌性，使这种材料可以更好的应用在人们的生活中。2.实验部分2.1 实验仪器与药品2.1.1 药品与试剂壳聚糖，浙江澳兴生物科技有限公司，脱乙酰度85%，相对分子质量1.8106；NaCl，天津市化学试剂研究所，工作基准试剂；AgNO3，上海申博化工有限公司，分析纯；冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司，分析纯；HNO3，分析纯；30NaOH，广西西陇化工厂汕头公司，分析纯；蛋白胨，上海化学试剂采购供应站中心化工厂；牛肉膏，北京奥博星生物技术有限公司；
8、葡萄糖，天津市津北精细化工有限公司；琼脂，脂海市长坡琼脂厂；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌均由上海复旦大学先进材料实验室提供；实验用水为蒸馏水。2.1.2 实验仪器DDS-11A型电导率仪，上海虹益仪器仪表有限公司；DJS-1C型电导电极，上海精密科学仪器有限公司；800B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；WHF7200型可见分光光度计，尤尼科（上海）仪器有限公司；NICOLET380傅里叶红外光谱仪，美国尼高力公司；LDZX
9、-50KB立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。2.2实验内容 2.2.1壳聚糖银配合物的制备在0.100g壳聚糖粉末中加入25.00mL的AgNO3溶液，然后放置超声波清洗仪中，在一定温度条件下超声振荡反应。反应结束后，测定反应前后溶液中Ag+的含量，计算壳聚糖对Ag+的吸附量。并将配合物进行洗涤抽滤，配合物用蒸馏水洗涤多次，直至无Ag+检出；40干燥，即得到壳聚糖-银配合物。以壳聚糖对Ag+的吸附量为衡量指标，探讨了AgNO3浓度、反应时间、反应温度、pH值对Ag+的吸附量的影响。2.2.2电导滴定法测定溶液中银离子含量电导法是根据溶液的电导与被测离子浓度的关系来进行分析的方法。在滴定终
10、点前后溶液电导有显著转折的体系，可以进行电导滴定。实验中的Ag+与加入的Cl的反应为沉淀反应，在达到反应终点时溶液中离子含量降到最低值，后来加入的Cl又使溶液中离子含量上升，出现了显著的转折点，所以采用电导法来测定溶液中银离子含量。将反应结束后的溶液放在离心机中离心，吸取上层清液。用已知浓度的NaCl基准溶液在电导率仪上滴定上层清液，根据电导的确定上层清液的浓度，平行做三次，算得得到消耗的Ag+吸附量。壳聚糖对Ag+的吸附量（Qt）按公式1计算： Qt=V(0-t)/m （公式1） Qt壳聚糖的吸附量（mg/g）； 0初始溶液中Ag+的质量浓度（mg/mL）； t反应后溶液中Ag+的质量浓度（
11、mg/mL）； V溶液的体积（mL）； m壳聚糖的质量（g）。2.2.3红外光谱分析12采用KBr压片法，在傅里叶红外光谱仪上对壳聚糖、壳聚糖-银配合物的结构进行红外光谱表征，波数范围为400 -4000cm-1。2.2.4培养基的制作大肠杆菌琼脂培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L；用80.0g /L的氢氧化钠溶液调整pH值为7.0；120，0.1MPa，20min高压蒸汽灭菌。大肠杆菌培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，氯化钠10.0g/L；用80.0g /L的氢氧化钠溶液调整pH值为7.0；120，0.1MPa，20
12、min高压蒸汽灭菌。白色念珠菌琼脂培养基：蛋白胨10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L；用80.0g /L的氢氧化钠溶液调整pH值为6.4；120，0.1MPa，20min高压蒸汽灭菌。白色念珠菌培养基：蛋白胨10.0g/L，葡萄糖20.0g/L；用80.0g /L的氢氧化钠溶液调整pH值为6.4；120，0.1MPa，20min高压蒸汽灭菌。枯草芽孢杆菌琼脂培养基：蛋白胨15.0g/L，酵母浸膏0.5g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L；用80.0g /L的氢氧化钠溶液调整pH值为7.0；120，0.1MPa，20min高压蒸汽灭菌。枯草芽孢
13、杆菌培养基：蛋白胨15.0g/L，酵母浸膏0.5g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖20.0g/L；用80.0g/L的氢氧化钠溶液调整pH值为7.0；120，0.1MPa，20min高压蒸汽灭菌。2.2.5抑菌圈的测定13将滤纸片剪成小圆圈滤纸片（直径为6.0mm），分别浸泡在不同浓度的材料溶液中，15min后取出，晾干，待用。用浓度为5105cfu/mL5106cfu/mL的三种菌分别取200L于相应的培养基上，用涂布棒均匀地涂抹三次。用镊子将圆形滤纸片平整地贴于培养基上，各样片中心之间相距 50mm 以上，与平板的周缘相距 15mm 以上。将培养皿放置于37培养箱中。24h之后观察、记录结果。重复实验三次，用直尺测量抑菌圈直径，取平均值。2.2.6抑菌率-时间测定将各微生物菌种活化后，接种到肉汁蛋白胨固体培养基斜面上，置于37恒温培养箱中培养至细菌活化良好在相对应的培养基中配制一定浓度的菌悬液，使其经血球计数板计数后菌悬液的浓度为1106cfu/mL1107cfu/mL14。用1.00mL菌悬液加入到装有8.00mL 0.9%无菌生理盐水的试管中，用移液枪准确取经消毒的1.00mL浓度为2mg/mL的壳聚糖银配合物溶液分别放入试管中；同样的方法以0.9%的无菌生理盐水的试管作空白对照。所有的试管放在恒温摇床上37、转速130r/min下振
