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1、第九章 亲和纯化技术一、填空题1、亲和层析洗脱方法有 ， ， 。2、亲和力大小除由亲和对本身的 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂 、 、 、 、 等。3、亲和层析中常用作分离酶的配基有 ， ， 和 。4、亲和层析中非专一性吸附有 、 、 。5、亲和过滤指的是将 和 结合运用，它包括 和 两大方法。二、选择题1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是 （ ）A.载体必须能充分功能化。B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是 （ ）A.
2、大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不确定3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作 （ ）A. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 竞争洗脱 D. 非竞争洗脱4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作 （ ）A. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 正洗脱 D. 负洗脱三、名词解释1、亲和反胶团萃取（Affinity-based resersed micellar extraction）：2、亲和膜：3、二次作用亲和沉淀（secondary-effect affinity precipitation）：4、亲和萃取：5、亲和吸附剂：6、负洗脱： 四、问答题1、
3、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？2、对亲和层析的公式 进行说明。设 KL=10-7，求L0 （6分） 3、何谓“手臂”？其长短与亲和层析效果有何联系？为什么？4、从亲和沉淀的机理和分离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。第九章 亲和纯化技术（答案）一、填空题1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱 ， 特殊洗脱， 专一性洗脱。2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂 微环境 、 载体空间位阻 、 载体孔径 、 配基和配体的浓度 、 配基结构 等。3、亲和层析中常用作分离酶的配基有 酶抑制剂 ， 辅酶 ， 底物 和 底物结构类似物 。4、亲
4、和层析中非专一性吸附有离子效应、疏水基团、复合亲和力。5、亲和过滤指的是将 亲和层析 和 膜过滤技术 结合运用，它包括 亲和错流过滤 和 亲和膜分离 两大方法。二、选择题1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是 （ B ）A.载体必须能充分功能化。B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是 （ A ）A.大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不确定3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作 （ C ）A. 阴性洗脱 B. 剧
5、烈洗脱 C. 竞争洗脱 D. 非竞争洗脱4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作 （ D ）A. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 正洗脱 D. 负洗脱三、名词解释1、亲和反胶团萃取（Affinity-based resersed micellar extraction）：是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。2、亲和膜：利用亲和配基修饰微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变
6、型。将一张微滤膜比喻为一个固定床，则膜厚即为床层高度.优点是传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高；压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。3、二次作用亲和沉淀（secondary-effect affinity precipitation）：利用在物理场（如pH、离子强度、温度和添加金属离子等）改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法成为二次作用亲和沉淀。4、亲和萃取：利用聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）或聚乙二醇/无机盐等双水相系统萃取分离蛋白质等大生物分子，特别是胞内
7、酶的双水相萃取法。利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。5、亲和吸附剂：由载体及配基偶联构成，在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand），与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。6、负洗脱：在双底物反应中，与配基互补的酶的亲和吸附，如果吸附取决于A物的存在与否，则洗脱液中除去A物时，吸附在配基上的互补分子也会洗脱下来，这种洗脱方法也称负洗脱。四、问答题1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？答：亲和层析的设计和过程大致分为以下三步：1）配基固定化：选
8、择合适的配基与不溶性的支撑载体偶链，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质；2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除；3）样品解析：选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其他生物活性物质解析下柱。亲和层析技术的最大优点在于，利用它从提取液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。此外亲和层析还有对设备要求不高、操作简便、适用范围广、特异性强、分离速度快、分离效果好、分离条件温和等优点：其主要缺点是亲和吸附剂通用性较差，故要分离一种物质差不多都得重新制备专用的吸附剂。另外由于洗脱条件较苛刻，须很好地控制洗脱条件，以避
9、免生物活性物质的变性失活。2、对亲和层析的公式 进行说明。设 KL=10-7，求L0 （6分） Ve为洗脱体积（1分）；V0固定相（柱床）体积（1分）；L0为固定化配基浓度（1分）；KL为亲和对解离常数（亲和势）（1分）；只有当阻留值10时，亲和层析才是有效（分离）的。1+L0/ KL 10，将KL =10-7代入得：L0/10-79，所以，L0910-7（2分）。3、何谓“手臂”？其长短与亲和层析效果有何联系？为什么？答：有时候用小分子物质（如酶的辅因子）作为配基直接偶联至琼脂糖凝胶珠粒上制备亲和层析介质时，尽管配基和酶间的亲和力在合适的范围内，但其吸附容量往往是低的。这是由于酶的活性中心常
10、是埋藏在其结构的内部，它们与介质的空间障碍影响其与亲和配基的结合作用。为了改变这种情况可在载体和配基间插入一个物质称为“手臂”，以消除空间障碍。手臂的长度是有限的，不可太短也不可太长，太短不能起消除空间障碍的作用，太长往往会使非特异性吸附增加。4、从亲和沉淀的机理和分离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。答：从亲和沉淀的机理和分离操作的角度可以看出，亲和沉淀纯化技术具有如下优点：1）配基与目标分子的亲和结合作用在自由溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快；2）亲和配基裸露在溶液之中，可更有效的结合目标分子，即亲和沉淀的配基利用率高；3）利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大；4）亲和沉析法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物的纯化，因此可在分离操作的较初期采用，有利于减少分离操作步骤，降低成本。同时，在分离过程的早期阶段除去对目标产物有毒的杂质（如蛋白酶），有利于提高目标产物质量和收率。
