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1、实验六 蛋白质的性质（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定（一） 目的1、了解蛋白质的两性解离性质。2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。（二）原理蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶掖的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此蛋白质的等电点(p1)。不同的蛋白质有其各自的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质来测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是利用物质在达到等电点时溶解度最小的性质，测定蛋白质溶液的溶解度呈现最
2、低时的溶液pH值，此时的pH倍即为该蛋白质的等电点。 本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度，来测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值的缓冲液然后向各缓冲溶液中加入酪蛋白，观察沉淀出现并测定酪蛋白的等电点。 （三）实验器材1、水浴锅。2、温度计。3、200mL锥形瓶。4、100mL容量瓶。5、移液管。6、试管。7、试管架。8、研钵。（四） 材料与试剂 1、0.5酪蛋白醋酸钠溶液：取0.5g酪蛋白加少量水在研钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质液移入200 mL锥形瓶内，并用少量4050的温水洗涤研钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10 mLlmol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放入50
3、水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至到度，塞紧玻璃塞，混匀。2、1mo1/L醋酸溶液。3、0.1mo1/L醋酸溶液。4、0.01mo1/L醋酸镕液.（五） 操作方法1、取同样规格的干燥试管9支,按表3-8顺序分别准确地加入各试剂，然后混匀。试管编号123456789加入试剂蒸馏水2.403.202.003.003.501.502.753.381mo1/L醋酸（ml）1.600.800.1mo1/L醋酸（ml）4.002.001.000.500.01mo1/L醋酸（ml）2.501.250.62酪蛋白醋酸钠（ml）1.001.0
4、01.001.001.001.001.001.001.00溶液最终pH3.53.84.14.44.75.05.35.65.9沉淀出现情况2、。静置20min后，再观察每支试管内溶液的混浊度，以、，符号表示沉淀的多少，根据观察结果，指出那一个pH是酪蛋白的等电点。二、蛋白质的沉淀及变性（一）目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。（二）原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 1、可逆的沉淀
5、反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，沉淀的蛋白质仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙醇)短时间作用蛋白质等。一般在纯化蛋白质时，常利用此类反应。 2、不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质因变性而沉淀，除去引起沉淀的因素后，蛋白质不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固、蛋白质与重金属离子或某些有机园的反应等都属于此类。 但蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 （三）材料与试剂1
6、、蛋白质样液；与双缩脲反应相同。2、饱和硫酸铵溶液3、固体硫酸铵。 4、5Cu2SO4溶液。 5、3AgNO3溶液。 6、0.1Na0H溶液。 7、10醋酸溶液。 8、95酒精； 9、固体氯化钠。10、1醋酸溶液。11、10醋酸溶液。12、10氢氧化钠溶液。13、饱和氯化钠溶液。14、饱和鞣酸溶液。 15、5三氯醋酸溶液。（四）操作方法1、蛋白质的盐析作用 (1)实验原理 一般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出，此现象称为盐析。盐析作用与两种因素有关；蛋白质分子被浓盐脱水；分子所带电荷被中和。 用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变
7、性，经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。(2)实验方法 取鸡蛋清约2mI于试管中，加等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，即有蛋白质析出静置数分钟，用滤纸过滤，沉淀即为卵球蛋白。滤液若不澄清可重复过滤至澄清。 将上述卵球蛋白沉淀用2m1半饱和硫酸铵溶液洗涤一次，然后取少量沉淀(约火柴头大小)放入1ml蒸馏水中，观察是否溶解，并用黄色反应鉴定之。 将析出卵球蛋白后的滤液放于试管中再加入固体
8、硫酸铵使达到饱和，观察有无沉淀析出，若有沉淀，则过滤之。滤液加热，并观察有无沉淀产生，记录结果，解释现象。滤出的沉淀即为卵清蛋白，可取少量(火柴头大小)溶于lml蒸馏水，观察是否复溶，并用黄色反应鉴定之。2、重金属盐类沉淀蛋白质 (1)实验原理 溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如铅、铜、汞、银离子等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。 重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。 (2)实验方法 取试管4支，按下表所示滴加试剂。 加毕揺匀，观察各管中变化，记录结果并解释
9、原因。若在1、2两管中加入过量Cu2SO4和AgNO3试剂，又有何结果，观察并记录之。3、酒精沉淀蛋白质 （1)实验原理 蛋白质不溶于某些有机溶剂(如乙醇、丙酮等)，若向蛋白质水溶液中加入酒精使达到一定浓度时，则蛋白质沉淀析出。酒精能使蛋白质胶体颗粒脱水，降低其在水溶液中的稳定性，且沉淀不同蛋白质所需酒精浓度也不同。溶液中若加少量中性盐(如NaCl)，沉淀将更加迅速和完全。 (2)实验方法取试管1支加4滴蛋白质样液及一小撮(火柴头大小) NaCl晶体，摇匀使溶解。向试管中徐徐加酒精数滴，强力振摇，观察结果并阐明其原理。 4、加热沉淀蛋白质 (1)实验原理 大多数蛋白质在加热时，由于空间结构被破
10、坏而丧失其稳定性，因此变性凝固。 蛋白质的热变性作用与加热时间平行，并随温度的升高而加快。短时间加热可能不引起凝固。 加热时，盐类的存在及溶液酸碱度对蛋白质的凝固有很大影响。处于等电点状态的蛋白质加热时凝固最完全、最迅速。在强酸强碱溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热也不凝固。但溶液中若有中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。(2)实验方法取试管5支依下表所示添加试剂。加毕混匀，将5支试管同时置于沸水浴中加热并观察现象，解释原因。 5、生物碱试剂沉淀蛋白质 (1)实验原理 生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。凡能便生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液PH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成不溶性盐而沉淀。 (2)实验方法 取试管2支，按下表所示滴加试剂。加毕混匀，观察并记录结果，解释原因。三、思考题1、在蛋白质等电点测定过程中，如何根据实验现象判断酪蛋白的等电点?为什么?2、蛋白质盐析实验中，被硫酸铵析出的卵清蛋白，在加入蒸馏水后沉淀是否溶解?3、为什么鸡蛋清可用作铅中毒和汞中毒的解毒剂?4、被硝酸银沉淀的蛋白质，在加入少量水后，沉淀是否溶解?为什么?5、被三氯乙酸沉淀的蛋白质，在加入少量水后，沉淀是否溶解?为什么？
