液相色谱仪操作规程

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1、实验教学中心仪器操作规程（管理员用）液相色谱仪2014 年 6 月 4 日制定2017 年 3 月 1 日修订一、开机及配置仪器1. 检查流动相： 量是否能满足使用，不够要注意及时添加； 纯水和缓冲盐流动相每天更换； D 通道 10% 的甲醇溶液每周更换 2 次，负责冲洗色谱柱、清洗针、清 洗缓冲环、灌注注射器； 小瓶 10% 的甲醇溶液每周更换 2 次，负责清洗泵头密封圈，更换之 后需清洗柱塞杆（本仪器每小时自动清洗一次，可不清洗）；2. 打开主机： 依次打开泵、自动进样器、柱温箱的开关，等待各部件电源灯和状态 灯点亮； 正确连接色谱柱和检测器（柱 - 紫外、柱 - 荧光、柱 - 紫外 -

2、荧光）； 打开相应检测器开关（未配置的检测器可不打开），等待其电源灯点 亮；3. 配置仪器： 打开电脑； 打开右下角仪器控制器； 调用合适的仪器配置模板（ E 盘 HPLC 配置备份中选择，单紫外、单 荧光、紫外-荧光串接）； 关闭仪器控制器，保存；4. 打开工作软件： 打开工作软件； 仪器 -主页界面确认各部件都被勾选，等待连接灯点亮；二、系统平衡1.流动相管道脱气：（目的是置换管道内流动相） 旋松排气阀（金色旋钮、逆时针约两圈）； 仪器 -泵界面，调整 D 通道流动相比例为 100% ，勾选冲洗（忽略警 告执行），观察D通道管路内无气泡时可对其他通道进行脱气，每 次开机必须对D通道脱气；

3、依次按步骤对欲使用的流动相通道进行脱气，不使用可不脱气，脱气完毕，旋紧排气阀； 设定流动相比例和流速（流速一般为1 mL/min）,勾选打开泵马达;2. 自动进样器灌注： 仪器-进样器界面，灌注注射器（至少 3 次），观察注射器内无气泡为止，等待模块状态变为绿色 Ready 时执行下一步操作； 清洗缓冲环； 清洗进样针（若在方法中设为进样前清洗或进样前后都清洗，则此处 可不清洗）；3. 柱温： 设定温度为方法中要求的温度； 没有特殊要求，一般设定温度为室温（冬季25C、春秋30C、夏季35C）,也可以不设定；4. 紫外检测器设定（使用时设定）： 勾选打开D灯和W灯（可根据实际使用情况选择只打开

4、其中一个,开灯时确保流动相经过色谱柱和检测器），等待紫外检测器状态灯 点亮，预热平衡30分钟； 参照方法要求设置波长； 监视基线，基线稳定后平衡结束，停止监视基线，开始准备进样；5. 荧光检测器设定（使用时设定） 根据方法设置激发波长（EX）和发射波长（EM）； 监视基线，基线稳定后平衡结束，停止监视基线，开始准备进样；三、创建方法（数据 创建仪器方法）1. 仪器参数： 选择 U3000；2. 信号采集参数： 采集时间设定（需优化，要确保样品中所有组分都出峰，避免影响后续样品的测定）； 检测器选择（配置为单一检测器时无此步骤）； 诊断通道设定为泵压力；3. 流动相参数： 流动相名称一般要输入，

5、避免遗忘； 压力下限设定为 510bar ，压力上限设定为 300400 ； 加速度、减速度一般不动；4. 流速参数： 删除平衡阶段； 调节流速和流动相比例进行等度设定，直接输入百分数值； 如需进行梯度设定，则依次添加时间、流速、比例、梯度变化速率， 第一梯度和最后梯度的流速和比例应一致，以保持基线稳定；5. 自动进样器参数： 吸取速度设为3yL/s （样品粘度大时应减小），吸取延迟设为3s； 排出速度设为15yL/s,排出延迟设为0s； 排出到废液速度设为20yL/s； 取样高度（针尖距瓶底）设为 2mm； 进样冲洗设为前洗，冲洗体积设为100200yL，冲洗速度设为1520yL/s；f 宀

6、 nt46. 进样模式： 一般不动，不选旁路；7. 柱温箱参数： 设定温度为方法中要求的温度； 没有特殊要求，一般设定温度为室温（冬季25C、春秋30C、夏季35C）,也可以不设定；8. 紫外检测器参数（使用时设定）： 根据待测物质选择测定波长； 测定波长带宽设定为45nm,为采集数据时前后延展的峰宽总和； 参比波长一般不设置，为所需扣除的背景吸收相对应的波长； 参比波长带宽一般为30nm,参比波长下限需远离测定波长上限； 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 1015Hz 即可；9二极管阵列检测器参数（紫外检测器绘制AtX三维图谱时设定）： 根据待

7、测物质选择测定波长范围； 束宽设定为 1nm ，相当于扫描波长间隔； 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 1015Hz 即可；10. 时间表（需使用波长数目多于通道数目时使用）： 可测定不同时间不同波长的吸光度；11. 荧光检测器参数（使用时设定）： 根据待测物质选择激发波长和发射波长； 选择 2D 数据； 选中温度设置并设定温度为40C（高于室温15C以上）； 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 1015Hz 即可；12荧光检测器3D参数（使用时设定）： 根据待测物质选择激发波长和发射波长； 选择3D

8、数据，并根据需要选择发射波长扫描、激发波长扫描或同步扫描； 选中温度设置并设定温度为40C（高于室温15C以上）； 峰宽理论上为色谱图中最窄峰的半峰宽，设定时选中使用推荐值，调整峰宽使采集频率介于 1015Hz 即可；13保存 保存至“ 01- 仪器方法”文件夹； 注释为主要条件（流动相比例、时间、波长等）； 命名为日期+顺序号+用户名；四、创建序列（数据 创建 序列）1仪器选择： 选择 U3000；2参数设置： 设置名称格式； 根据需要设置样品数和平行进样次数； 设置开始进样位置，注意要和样品所放位置一致； 进样量一般设为20 口 L；3. 方法调用： 调用仪器方法； 调用处理方法、报告模板

9、、视图位置等；4. 生成样品表： 保存至“ 05- 序列”文件夹； 注释为样品参数（标样、试样、进样量等）； 命名为日期+顺序号+用户名；五、运行样品表1. 设置进样列表参数： 根据需要设置样品类型、标样级别； 可根据需要修改样品名称；2. 运行样品表： 点击队列面板； 添加待运行的序列； 确认完成序列后是保持仪器就绪状态（不是运行智能待机或运行智能关机）； 点击就绪检查，检查无误后开始运行序列；六、数据处理（数据 序列）1. 选择序列 数据 -序列； 选择已完成的待处理序列；2. 样品类型： 标样选择校准标准品； 试样选择未知； 溶剂或空白样选择基质；3. 标样级别： 标样按浓度由低到高依次

10、设定级别（新建级别）； 保存；4.检测参数设置： 双击中间浓度标样的色谱峰，进入数据处理界面 校准和处理，检测，运行 Cobra 向导； 若溶剂峰为倒峰，勾选考虑塌陷峰； 自动选择积分时间、基线噪声范围、平滑宽度、最小峰面积； 通道设置为所用通道；5. 组分表参数设置： 校准和处理，组分表，运行组分表向导，不需设置； 生成样品表，双击窗口下方条格，选择相对值最接近的峰，5%； 评估类型可以选择峰面积或峰高； 校准品方法可以选择外标法或内标法； 校准类型选择过原点或者不过原点； 若是多组分或混合标样，可F9快捷向下填充或者点击右键向下填充; 输入标样的实际浓度和浓度单位； 可删除杂峰组分，修改组

11、分名称，然后保存；6. 看结果： 峰结果是某一样品各组分的含量，进行定量分析； 校准可观察标曲的相关系数；七、打印报告（数据处理界面）1.内容： 总览，序列详细信息； 积分，每个样品各组分峰的结果（峰高、峰面积等）； 校准，标准曲线及其指标； 峰分析，峰的指标（峰宽、不对称度，塔板数等）； SST， 光谱结果，三维曲线扫描（DAD检测器）； 光谱库筛选，三维曲线比对结果； 总结，主要参数列表（保留时间、峰面积、峰高、样品量、峰类型）； 2.报告出具： 定量分析，一般选择积分、校准和总结即可，其他根据需要选择；八、待机（短时不用仪器时选择）1.清洗色谱柱： 流动相中含盐，10%甲醇清洗所用通道

12、30min ，100%甲醇或乙腈清洗 30min； 流动相中不含盐， 100%甲醇或乙腈清洗所用通道 30min； 2.低流速冲洗： 设置流动相为纯有机相； 流速设置为 0.1 或 0.05mL/min ； 注意调节压力下限为 0；3. 智能待机 序列界面选择 0-Wash 序列； 根据流动相是否有盐选择冲洗方法（无盐方法 1 、有盐方法 2 ）； 将序列状态由完成改为空闲，并保存； 提交序列，在序列界面设置完成后运行智能待机（下次运行序列前需 改为保持仪器就绪）；九、关机1.关闭紫外灯： 若使用紫外检测器，去掉勾选关闭 D 灯和 W 灯；2.清洗色谱柱： 流动相中含盐，10%甲醇清洗所用通道

13、 30min ，100%甲醇或乙腈清洗 30min； 流动相中不含盐， 100%甲醇或乙腈清洗所用通道 30min；3. 关闭泵马达： 等待柱温低于40C，去掉勾选关闭马达；4. 依次断开各模块和软件的连接5. 依次关闭工作软件、电脑、仪器各模块6. 智能关机 序列界面选择 0-Wash 序列； 根据流动相是否有盐选择冲洗方法（无盐方法 1 、有盐方法 2 ）； 将序列状态由完成改为空闲，并保存； 提交序列，在序列界面设置完成后运行智能关机（下次运行序列前需 改为保持仪器就绪）；九、其他注意事项1.用过缓冲盐的流动相通道应及时清洗，以免结晶磨损色谱仪部件；2.样品进样前一定经过必要的前处理，以防堵塞污染色谱通道和部件；3.避免手动旋转样品盘，以免位置发生偏移，损坏进样器；4. 突然断电时，应立即关闭主机电源开关，等待来电且稳定后再开机使用；5. 进样器附近禁止放置杂物，以免影响注射器驱动；6. 更换流动相时，要确保流动相之间的互溶，必要时要使用过渡溶剂。7. 停止冲洗或停流动相时关掉泵马达即可，不使用暂停或停泵。8. 序列前的方块为智能启动，不勾选。