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1、 双向电泳实验流程l 样品制备（Sample preparation）l 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）l 第一向等电聚焦（IEF）l 胶条的平衡（IPG strip equilibration）l 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis）l 凝胶的染色及检测（Detection/Staining）l PDQuest软件分析（Software analysis）l 质谱鉴定（Protein identification）目录第一章双向电泳1. 1 溶液配制1. 2 操作步骤1. 3 注意事项第二章订货信息附录1双向电泳完整的
2、操作步骤附录2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章 双向电泳1. 1 溶液配制水化上样缓冲液（I）尿素8M4.805gCHAPS 4%0.4gDTT65mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。水化上样缓冲液（II）尿素7M4.2g硫脲2M1.52gCHAPS 4%0.4gDTT65mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%1
3、0ml（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。水化上样缓冲液（III）尿素5M3.0g硫脲2M1.52gCHAPS 2%0.2gSB 3-10 2%0.2gDTT65mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375M pH8.825ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）甘油20%20mlMilliQ水定容至100ml
4、分装成10管，每管10ml，-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液10mlDTT0.2g充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g 充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml（10% SDS）溴酚蓝0.001%100ml（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至100ml加热溶解至澄清，室温保存。30% 聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8Tris碱
5、90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。10% SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10% ApAp0.1gMilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4冰箱保存。10电泳缓冲液（1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。1. 2 操作步骤（一）第一向等电聚焦（用自制溶液）1. 从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml
6、/管），置室温溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte按照如下表格1ml的量加，充分混匀。IPGpH RangeBio-Lyte Ampholyte(Stock)Range Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 1ml per 5ml per 50ml3-103-1040%5ul25ul250ul4-74-640%2.5ul12.5ul125ul5-740%2.5ul12.5ul125ul3-63-520%5ul25ul250ul4-640%2.5ul12.5ul125ul5-85-840%5ul25ul250ul7-107-940%2.
7、5ul12.5ul125ul8-1020%5ul25ul250ul3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。其中水化缓冲液与样品的比例不得小于4:1。具体的上样体积如下表，ReadyStripTM IPG胶条的长度上样体积7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul18cm315ul-630ul24cm410ul-820ul其中蛋白质的上样量与染色相关。具体的蛋白质上样量如下表，IPG胶条的长度分析型的上样量（银或SYPRO Ruby染色）制备型的上样量（考马斯亮蓝染色）7 cm10-100ug蛋白200-500ug
8、蛋白11cm50-200ug蛋白250-1,000ug蛋白17cm100-300ug蛋白1-3mg蛋白4. 从冰箱取-20冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10分钟。5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背
9、面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。8. 在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。IPG胶条的长度矿物油体积7 cm1 ml11cm2 ml17cm3 ml18cm3ml24cm5ml9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。7cm胶条水化12小时（17）被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速60分钟除盐S34000V线性3小时升压S44000V快速24,00
10、0伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（30-50mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）11cm胶条水化12小时（17）被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速60分钟除盐S37000V线性4小时升压S47000V快速40,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（50mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）17cm胶条水化12小时（17）被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速2小时除盐S38000V线性5小时升压S48000V快速60,000伏
11、小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（50-70mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）18cm胶条水化12小时（17）被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速2小时除盐S38000V线性5小时升压S48000V快速60,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（50-70mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）24cm胶条水化12小时（17）被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速2小时除盐S310000V线性5小时升压S410000V快速80,00
12、0伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（50-70mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20冰箱保存1到2天。（二）第二向SDS-PAGE电泳1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。3. 从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。4. 配制胶条平衡缓冲液I。5在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在
