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1、相关生化及分子生物学大优选-实验实验 20 质粒 DNA 的提取与判定讲课题目：质粒 DNA的提取与判定（ 6 学时）讲课对象：生科专业讲课教师：教课目的及基本要求：1、学习和掌握迅速提取质粒 DNA 的原理和方法。2、学习和掌握质粒 DNA 的判定。3、采纳开放性实验教课。教课内容概要实时间分派：1、实验原理解说： 8 分钟? 碱变性法提取质粒 DNA是鉴于染色体 DNA与质粒 DNA的变性和复性的差别而达到分别的目的。在 pH值高达的碱性环境中，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋构造解开；质粒 DNA的大多数氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完好分别。当用 pH值的 KAc或 Na
2、Ac高盐缓冲液调理其 pH值到中性时，变性的质粒 DNA又恢复到本来的构型，保留在溶液中；而线状染色体 DNA则不可以复性，形成环绕的网状物 , 经过离心，染色体 DNA与不稳固的大分子 RNA、蛋白质 -SDS复合物一同积淀下来而被除掉，用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒 DNA积淀，再用 RNase除掉 RNA，即可获取较纯净的质粒 DNA。2、实验试剂与器械 6 分钟? 溶液： 50 mmol/L 葡萄糖， 25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0) ，10mmol/L EDTA (pH8.0) 。高压灭菌 15 分钟，储藏于 4冰箱。? 溶液： 0.2 mol/L NaOH （
3、临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释），1 SDS（从 10% SDS母液中稀释， SDS母液可室温保留），现配现用。? 溶液： 5 mol/L KAc 60mL ，冰醋酸，高压灭菌， 4冰箱保留。溶液终浓度为 : K+ 3mol/L, Ac 5mol/L 。? 3 mol/L 醋酸钠 (pH5.2) ：800 mL 水中溶解 408. 1g NaAc 3H2 O，用冰醋酸调 pH 至，加水定容至 100mL，分装后高压灭菌，储藏于 4冰箱。1 / 13? STE缓冲液：，10mmol/L Tris Cl(pH8.0) ，1mmol/L EDTA (pH8.0) 。? TE 缓冲液：
4、10mmo/LTris Cl (pH8.0) ，1 mmol/L EDTA(pH8.0) 。高压灭菌后储藏于 4冰箱中。3、实验步骤解说： 6 分钟? 将含有质粒 pGFPuv 的 DH5 菌种划线接种在 LB 固体培育基（含有 100 g/mLAmp）上，37培育 12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5mL LB 液体培育基 (含有 100 g/mLAmp) 中，37振荡培育 1416 小时。? 取 1.5 mL 培育液加入 1.5 mL 离心管中，室温 12, 000 r/min 离心 1 分钟。? 加入 500 L STE，涡旋打匀，室温 12, 000 r/min 离心 1
5、分钟。? 弃上清，将管倒置于纸巾，使液体流尽。? 加入 100 L 溶液重悬菌体，涡旋振荡，冰浴 5 分钟。? 加入新配制的溶液 200L，盖紧管口，迅速柔和颠倒 5 次，至溶液澄清 (千万不要振荡 )，冰浴 5 分钟。? 加入 150L预冷的溶液，盖紧，管口朝下，柔和振荡 510 次，冰浴 510 分钟，12, 000r/min 离心 10 分钟。? 取上清移入洁净 Eppendorf 管中，加入等体积的酚 :氯仿:异戊醇 (25:24:1)，强烈振荡 20 秒。? 室温下 12,000 r/min 离心 5 分钟，可见溶液分三层，上层为质粒 DNA 溶液，中层为蛋白层，基层为有机相。? 取
6、上清，加入 400L 氯仿 :异戊醇 (24:1)，强烈振荡 20 秒。? 12,000r/min 离心 5 分钟。? 加入 1/10 体积 3M NaAc ，2 倍体积无水乙醇， 4积淀 10 分钟或室温积淀 20 分钟。? 12,000rpm 离心 10 分钟。? 去上清，加入 1mL 75% 乙醇，清洗积淀以去盐。 12,000rpm 离心 10 分钟。? 去上清，吸出痕量节余乙醇，风干。? 将积淀溶于 30LT E 缓冲液，含 20g/mL RNaseA)中，储于 -20冰箱中。如直接酶切，可将积淀溶于 3050L ddH2O（含 20g /mL RNaseA）。? 利用比色法测定质粒
7、 DNA 在 260 nm 和 280 nm 下的光汲取值并计算样品浓度。用 1%琼脂糖凝胶电泳察看质粒 DNA 的纯度和条带。教课要点及难点：1、碱变性法提取质粒 DNA的原理。教课方法：采纳启迪式教课，联合理论，对实验步骤进行剖析并给于适合示范。教课手段（挂图、幻灯、多媒体等）：板书， PPT。使用的教材及参照资料：1、现代生物学实验，熊大胜主编，中南大学第一版社， 20052、分子生物学实验指导，魏群主编，高等教育第一版社， 20063、分子克隆实验指南（第三版） J.萨姆布鲁克等著金冬雁、黎孟枫等译科学第一版社 1999思虑题：1、碱法提取质粒过程中， EDTA 、溶菌酶、 NaOH、
8、SDS、乙酸钾、酚 /氯仿等试剂的作用是什么 ?2、质粒提取过程中，应注意哪些操作，为何 ?3、用碱裂解法提取的质粒 DNA 往常都污染有细菌 RNA 分子，你采纳什么策略能够去除RNA污染？4、假如你提取的质粒 DNA污染有少许的染色体 DNA ，那么你在操作过程中哪几步最可能出现了问题？5、你提取的质粒 DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中表现出几条带？可否利用你所学习的知识解说这类现象？本单元教课总结（教课的主要经验、成效、存在的问题、改良举措等）1、联合理论内容叙述实验内容，采纳开放性实验教课，成效较好。2、重申实验操作规范，让学生养成优秀的实验习惯。实验 21 RNA 的提取及判定讲课题目
9、： RNA的提取及判定（ 6 学时）讲课对象：生科专业讲课教师：教课目的及基本要求：1、学习和掌握提取总 RNA 的原理和方法；2、学习和掌握总 RNA 浓度测定、质量及纯度的判定方法；3、熟习并掌握琼脂糖凝胶电泳技术与紫外分光光度计的使用方法。4、采纳开放性实验教课。教课内容概要实时间分派：1、实验原理解说： 12 分钟? 总 RNA的提取真核细胞质总 RNA 主要由 rRNA （80-85%）、tRNA 和核内小分子 RNA(10-15%) 、mRNA（1-5%）构成，此中 rRNA 、tRNA 和 mRNA 位于细胞质中。完好 RNA 的提取和纯化，是进行 RNA 方面的研究工作，如 N
10、othern 杂交、 mRNA 分别、RT-PCR、定量 PCR、cDNA 合成及体外翻译等的前提。全部 RNA 的提取过程中都有五个要点点，即）样品细胞或组织的有效破裂；）有效地使核蛋白复合体变性；）对内源 RNA 酶的有效克制；）有效地将 RNA 从 DNA 和蛋白混淆物中分别； 5）关于多糖含量高的样品还涉及到多糖杂质的有效除掉。但此中最要点的是克制 RNA 酶活性。 RNA 的提取当前阶段主要可采纳两种门路，1)提取总核酸，再用氯化锂将 RNA 积淀出来； 2)直接在酸性条件下抽提，酸性下 DNA 与蛋白质进入有机相，而 RNA 留在水相。? 紫外分光光度法测定总 RNA浓度及纯度判定
11、核酸分子中的碱基含有共轭双键，拥有必定的紫外汲取特征，其最大汲取峰的波长为260nm。此外，核酸分子在双链向单链形式转变过程中，紫外汲取增添，故单链 DNA 及 RNA分子较双链 DNA 分子拥有更高的紫外汲取能力。这些物理特征为测定核酸样品浓度供给了基础。在波长为 260nm，光程为 1cm，A2601 时，相当于双链 DNA 浓度为 50g/mL，单链 DNA 或 RNA 为 40g/mL，单链核苷酸为 20g/mL。紫外分光光度法可用于测定浓度大于g/mL的核酸浓度。分光光度法不只能测定核酸浓度，还可经过测定在 260nm 和 280nm 的紫外汲取比值（A 260 / A280）预计核
12、酸的纯度。纯净的 DNA 样品的 A260 / A280 为，纯净的 RNA 制品的A260 / A280 为。DNA 样品中存在将致使比值高升，而比值降低表示有蛋白质或苯酚等污染。RNA 浓度计算公式： C(g/mL)40g/mL 1光/ 程A260 稀释倍数? 琼脂糖凝胶电泳技术检测总 RNA浓度和质量琼脂糖英文名 agarose，是由经过优选、质地较纯的琼脂（ agar）作原料制成的。琼脂化学构造上是由琼脂糖和琼脂胶（ agaropectin）构成的复合物。琼脂胶是一种含有磷酸根和羟基的多糖，它拥有离子互换性质，这类性质将给电泳及凝胶过滤以不良影响。琼脂糖是一种直链多糖，它由 D-半乳糖
13、和 3,6-脱水-L- 半乳糖的残基交替摆列构成。琼脂糖和琼脂同样也能形成凝胶。形成凝胶主假如因为氢键的缘由。因为琼脂糖拥有亲水性及不含带电荷的基团，所以极少惹起敏感的生物化学物质的变性和吸附。琼脂糖凝胶电泳是实验室中最早获取宽泛应用的凝胶电泳，是分别判定核酸的惯例方法。因为它拥有以下长处： 1）琼脂糖凝胶中含有琼脂 1.0%-1.5% ，在这类凝胶中电泳，近似自由界面电泳，可是样品的扩散度比自由电泳小； 2）琼脂糖凝胶电泳支持物平均，电泳区带齐整，分辨率高，重复性好； 3）液相与固相界面无显然界线，电泳速度快； 4）琼脂糖凝胶透明而不汲取紫外线，能够直接用紫外检测仪作定量测定； 5）区带易染
14、色，样品易回收。核酸分子在高于其等电点的电泳缓冲液中带负电荷，在电场中向正极挪动。分子大小不同的核酸分子拥有各异的电泳迁徙率，而在电泳后处于凝胶的不一样地点。影响其电泳迁徙率的要素包含电荷效应和分子筛效应。前者由分子所带的净电荷多少而定，这与电泳时电流强度、电泳缓冲液的 pH 值和离子强度相关；尔后者主要与核酸分子大小和其构象以及所用琼脂糖凝胶的浓度相关。2、实验试剂与器械 2 分钟液氮罐、陶瓷研钵、冷冻高速离心计、恒温水浴器、恒温培育箱、高压灭菌锅、紫外线透射仪、吸头、乳胶手套、紫外分光光度计、电泳仪、水平式电泳槽、微波炉、 Eppendorf微量离心管、微量加样器（ pipetman）、三
15、角烧瓶、烧杯、量筒。总RNA 提取试剂盒（ TRIzol TM试剂）、 0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC) 、75%乙醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、 10mg/ml EB 溶液、 5TBE电泳缓冲液（ 0.45 mol/L Tris 、mol/L EDTANa2 、0.45 mol/L 硼酸，）、溴酚蓝指示剂（0.25%溴酚蓝、 50%甘油）、DNAmarker。3、实验步骤解说： 5 分钟?组织总RNA 的提取把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适当的 Trizol试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上搁置 5 min。吸入离心管中，加入氯仿 (0.2mL/mL Trizol) ，冰上搁置 5min。10 000 g 离心 10 min，汲取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温搁置 10 min。10 000 g 离心 15 min，去上清，70%乙醇清洗积淀，室温风干，加 DEPC办理的双蒸水 (15-20 L溶) 解。4、总结 2 分钟教课要
