《生物化学实验2.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验2.doc（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物化学实验实验一 酶联免疫吸附试验(8学时)一、实验目的1. 掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理2. 学习间接竞争法检测抗原物质的基本操作二、实验原理酶联免疫吸附测定 (Enzyme-Linked Immunosorbent Asay，简称ELISA)是在免疫酶技术上发展起来的一种新型免疫测定技术，是应用酶标记的抗体 (或抗原)在固相支持物表面检测未知抗原 (或抗体)的方法。ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。竞争法ELISA的过程主要包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，封闭未被占据的吸附位点后，加入一定量特异性抗体
2、和样品，吸附的抗原和样品中的抗原与抗体竞争结合。再加相应酶标记抗体，生成抗原-抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，各孔的吸光度值与样品中抗原的浓度成反比。为提高检测的灵敏度，通常在酶标板上加入样品和抗体之前，先将两者以一定比例混合，于4 预孵育16 h左右。酶联免疫吸附试验是利用抗原-抗体的免疫学反应和酶的高效催化底物反应的特点，具有生物放大作用，所以反应灵敏，可检出浓度在ng水平。酶联免疫吸附试验中所使用的试剂都比较稳定，按照一定的实验程序进行测定实验结果重复性较好，有较高的准确性。酶联免疫吸附法成本低，操作简便，可同时快速测定多个样品，不需要特殊的仪器设备。三、实验器
3、材与试剂实验器材1. 96孔聚苯乙烯微量细胞培养板2. 八道移液器 (300 L)、单道移液器 (200L、1000L)3. 电子天平4. 恒温培养箱5. 离心机6. 酶联免疫检测仪 (酶标仪)实验试剂1. 包被液：0.05 mol/L pH9.6 碳酸缓冲液 (Na2CO3 0.15 g，NaHCO3 0.293 g，蒸馏水稀释至100 mL)，4保存。2. 稀释液：0.01 mol/L pH7.4 PBS-Tween-20 (NaCl 8 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO412H2O 2.9 g，Tween-20 0.5 mL，蒸馏水加至1000 mL)，4保存。3. 洗涤液：同
4、稀释液。4. 封闭液：5%豆粉，pH9.6 碳酸缓冲液。5. 酪蛋白溶液：15.6 ng/mL、31.2 ng/mL、62.5 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL和4000 ng/mL。6. 鲜奶。7. 酪蛋白抗体，工作稀释度为1:2000。8. 辣根过氧化物酶 (HRP)标记的羊抗兔IgG，工作稀释度1:1000。9. 邻苯二胺溶液 (底物)：临用前配制。0.1 mol/L 柠檬酸 (2.1 g/100 mL) 6.1 mL，0.2 mol/L Na2HPO412H2O (7.163 g/100 mL) 6.4
5、mL，蒸馏水12.5 mL，邻苯二胺10 mg，溶解后，临用前加30% H2O2 40 L。10. 终止液：2 mol/L H2SO4。四、操作步骤1. 包被：500 ng/mL酪蛋白，每孔150 L，37 孵育1 h后转入4 冰箱放置过夜；2. 洗涤：PBST洗板三次 (倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽)；3. 封闭：5%豆粉 (离心后使用)，每孔加300 L，37 封闭1 h；4. 洗涤：PBST洗板三次；5. 抗原抗体反应：将一定浓度的抗体或抗体和样品的混合物加入板孔 (提前预混合，4 过夜放置)，注意从高稀释度到低稀释度加样
6、，每孔150 L，37 孵育2 h；6. 洗涤：BST洗板三次；7. 抗原抗体复合物与酶标二抗反应：加入酶标二抗 (辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，每孔150 L，37 孵育1 h；8. 洗涤：PBST洗板三次；9. 显色：加入邻苯二胺溶液 (底物)，每孔100 L，37 ，闭光反应20 min；10. 终止反应：每孔加50 L 2 mol/L H2SO4 终止反应；11. 测定：用酶标仪于490 nm波长下测量各孔的吸光度值OD490nm；12. 数据处理：将测得的吸光度值OD490 nm扣除空白后，按照公式换算成抑制结合率B/B0(%)。以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值
7、为横坐标作图，绘制标准曲线，标准曲线用线性拟合。五、注意事项1. 正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持 3 min再弃去。2. 加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。3. 底物应在临用前配制，同时注意避光。六、思考题请查阅相关文献，指出ELISA有哪几种常用方法？各种方法在操作上有什么异同？应用有什么异同？实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量 (8学时)一、实验目的1. 学习电泳原理和技术2. 学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术二、实验原理蛋
8、白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动；反之则向负极移动，这种带电的颗粒在电场中泳动的现象称为电泳(electrophoresis)。不同的蛋白质由于等电点不同，在电场中的泳动速率也不同，因此应用电泳技术很容易实现对蛋白样本的分离与分析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate -polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)是目前用于测定蛋白质亚基分子量的常规方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N, N
9、-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵)和增速剂(N,N,N,N-四甲基乙二胺)的氧化-还原作用下聚合而成的。凝胶的有效孔径与它的总浓度T%成反变关系，在高浓度时，凝胶孔径小，可以筛分分子量小的多肽；低浓度时，凝胶孔径大，则可筛分大分子蛋白质。工作时，凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成，浓缩胶浓度低、孔径大，较稀的样品经过大孔径凝胶的迁移作用可被浓缩至一极窄的区带，以提高样品中各组分在分离胶中的分辨率。SDS是一种阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠。还原剂二硫苏糖醇 (dithiothreitol, DTT)或巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样本中加入SDS
10、和还原剂后，蛋白质分子将被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合，可形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异；然而，蛋白质亚基-SDS胶束的长轴长度与亚基分子量的大小成正比。因此，当这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率不再受蛋白质分子原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15 KD到200 KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。蛋白质SDS-PAGE常用于蛋白质分子量的测定，蛋白质纯度的分析，蛋白质浓度的检测，免疫印迹 (Western Bl
11、ot)的第一步，蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白的鉴定等。三、实验器材与试剂实验器材1. 垂直板电泳槽2. 稳压稳流电泳仪3. 脱色摇床实验试剂：1. 丙稀酰胺和N, N-亚甲双丙稀酰胺配制的29% (w/v)丙稀酰胺和1% (w/v) N, N-亚甲双丙稀酰胺的贮存液，置于棕色瓶中贮存于室温。小心：丙稀酰胺和N, N-亚甲双丙稀酰胺具有很强的神经毒性并容易被皮肤吸收。2. 10%十二烷基硫酸钠 (SDS)贮存液。3. 1 M pH 6.8的Tris缓冲液和1.5 M pH 8.8的Tris缓冲液。4. 过硫酸铵。5. TEMED (N, N, N, N-四甲基乙二胺)。6. Tris-甘氨酸电泳缓冲
12、液：25 mM Tris； 250 mM 甘氨酸 (pH 8.3) 0.1% SDS7. 样品处理液配方：50 mM Tris-HCl (pH 6.8) 100 mM DTT (or 5%巯基乙醇) 2% SDS 0.1%溴酚蓝 10%甘油9. 染色液：0.1%考马斯亮蓝R-250；40%甲醇；10%冰醋酸10. 脱色液：10%甲醇；10%冰醋酸四、实验方法SDS聚丙稀酰氨凝胶的灌制1. 安装玻璃板。2. 称取0.1 mg琼脂或琼脂糖于一小三角瓶或小烧杯中，加入10 ml Tris-甘氨酸电泳缓冲液，微波炉加热沸腾。用滴管或1 ml微量移液器吸取琼脂，对玻璃板各缝隙进行封口。封口后的玻璃板放入
13、4冰箱冷藏约20分钟，使琼脂凝结牢固。3. 按表1中给出的数值在一小烧杯中配制分离胶溶液。注意一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。表1 10%分离胶溶液的配制溶液成分总体积10 mL水2.3 mL30%丙稀酰胺5.0 mL1.5M Tris (pH8.8)2.5 mL10% SDS0.1 mL10%过硫酸胺0.1 mLTEMED0.004 mL4. 迅速在玻璃板的间隙中灌注丙稀酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需的空间 (梳子的齿长再加0.5 cm)。再在胶面上小心注入一层水 (约23 mm)高，以阻止氧气进入凝胶溶液。5. 将胶板放入37温箱1小时以上，待分离胶聚合完全后，倾出覆盖水层，
14、再用滤纸吸净残留水。6. 按表2中给出的数值制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。表2 5%浓缩胶溶液的配制溶液成分总体积5 mL水3.40 mL30丙稀酰胺0.83 mL1M Tris (pH6.8)0.63 mL10% SDS0.05 mL10%过硫酸胺0.05 mLTEMED0.005 mL7. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下或置于37温箱中保温。8. 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100加热3分钟以使蛋白质变性。9. 浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，注意胶板上开口朝向负极 (黑色)，上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。上样电泳1. 按预定顺序用微量移液器加样，加样量通常为1020 L。2. 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/ cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/ cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm，然后关闭电源。3. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。染色和脱色1. 染色时间：1520 min。2.
