高效液相色谱知识.doc

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1、（一）高压恒流泵的维护注意事项泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。应采取下列措施以延长使用寿命：绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。要用HPLC级试剂 输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。压力下限应设置在0.51MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失

2、去柱后清洗效果。 (二)流动相使用的注意事项必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45m薄膜过滤。过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。几种脱气方法比较： 1、 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。 2、 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。3、 抽真空脱气法：易抽走有机相4、 超声脱气法：一种较为常见的脱气法。流动相放在超声波容器中，用超声波震荡1015 分钟，此法效果并不太好但操作简单。如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下

3、列流动相：浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜 特别注意HPLC使用过后的系统清洗：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法： 1、 先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用35ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。 此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗2、 再用5：95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗3060分钟后停泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。3、 最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。 如果流动相中不含盐，则使用上述第三

4、步清洗即可。(三)流动相的更换在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。一定要注意前一种使用的流动相和所更换的流动相是不是能够相溶。如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要特别注意了。要采用一种与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相进行过滤、清洗。较为常用的过滤流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相。一般清洗时间为3040分钟，直至系统完全稳定。 如不进行以上“特别注意”上述步骤的操作，将会导致系统管路阻塞。严重时将引起流 通池污染堵塞，不得不更换流通池。用户就要承担不必要的损失了。 储液器的注意事项： 保持流动相储液

5、器的清洁是保证仪器正常使用的关键。要使用HPLC级的溶剂，对试剂含有缓冲盐及非HPLC级的流动相一定要用0.45m过滤器除区去其中的微量物质。仪操作步骤1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2）、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3）、打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4）、 进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5）、 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10

6、ml/min。6）、 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。7）、 设计走样方法。点击file，选取se-lect users nd methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。8）、 进

7、样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9）、 关液相色谱仪时，先关计算机，再关液相色谱。10）、 填写登记本，由负责人签字。注意事项：1）、 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。2）、 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。3）、 所有过柱子的液体均需严格的过滤。高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项-流动相： 1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过

8、滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围； 2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； 3、 使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。样品： 1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒； 2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为

9、定量管的35倍；色谱柱： 1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等； 2、 使用符合要求的流动相； 3、 使用保护柱； 4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6、 不要高压冲洗柱子； 7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱； 使用过程中注意轻拿轻放。实验前准备事项1.1 对照品的配制 1.1.1 配制方法取干燥情况下的对照品（注意是否吸潮），每次称取量不得少于5mg，置一定容量量瓶中，加入少量溶剂，超声溶解冷却后再定容

10、、混匀（高浓度）。再用移液管吸取12ml至先配制成高浓度的对照品，一定容量量瓶中，加入溶剂定容、混匀，即得（低浓度）。配置后的对照品均需用封口膜封好。1.1.2 配制浓度 严格按照标准配制对照品浓度（低浓度），不可超过或低于一倍。 1.1.3 所需玻璃仪器和容器 所需玻璃仪器和容器，尽量选用棕色容量瓶进行配制。每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。 1.1.4 标签 配制好的对照品标签上应注明：品名、批号、取样量、稀释倍数（浓度）、配制日期。 1.1.5 干燥器 干燥器中的干燥剂每月至少处理一次。 1.2 供试品的制备 1.2.1 取样方法 成品：取

11、10袋装量差异项下的样品，按照相关品种标准含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。 药材：取样袋中药材全部打粉至规定目数（一般为34号筛），按照05年版中国药典相关品种含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。 1.2.2 称样要求 用万分之一天平称取，使用中注意天平稳定。1.2.3 量取要求 均用移液管量取或刻度量管。1.2.4 所需玻璃仪器和容器 所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。 2 实验中注意事项2.1 实验仪器的准备 2.1.1 仪器安装后是否存在漏液现象？压力是否稳定？柱子是否安反？2.1.2 检

12、查完毕后，打开电脑、N2000工作站电源开关后，再打开泵电源开关、控制面板上泵开关。先用色谱甲醇冲洗柱子，等待机器平稳后，再打开检测器电源开关、控制面板上检测器开关。30分钟后方可进针做实验。 2.1.3 打开电脑桌面上的N2000在线工作站，选择通道，设定保存路径、波长（注意控制面板上同样需要设置）等实验信息。2.1.4 设定完毕后，点击数据采集、查看基线、零点校正后，注意观察电脑左下角电压值、时间值波动是否正常？ 电压不对：灯是否开启？如果开启还有问题，就重新开启工作站或检测器。 时间不对：调节采样频率（应为10帧/秒） 2.2 流动相的配制 所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干

13、净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。 先抽滤、后超声（10-15分钟） 2.3 测定法要求2.3.1 样品进样前先混匀，再用0.45m滤膜过滤，再混匀后进样。 2.3.2 对照品与样品进样量要尽量保持一致，样品峰面积与对照品峰面积尽量保持一致（不要超过一倍，可适当调整进样量或稀释倍数）。2.3.3 注意系统评价：理论板数（达到标准要求）、分离度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之间）。 2.3.4 平行进针要求RSD2。 2.3.5 进样针每次改进不同样品或对照品时，需用色谱甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超过进样量位置。 2.4 仪器使用过程中注意事项注意机器异常情

14、况的发生（声音），压力是否过高（超过200Bar不可再做实验），流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。 2.5 实验完毕后 可用甲醇冲洗一小时，如果流动相中含有酸或缓冲盐，则先用新鲜纯水冲洗0.5小时，再用甲醇冲洗一小时。 2.6 人参、西洋参等含量测定 做波长小于240nm的样品时，注意机器、柱子一定要加长冲洗时间，乙腈则改用进口乙腈。 2.7 保留时间改变的样品 用于实验时间加长，导致对照品与样品保留时间不一致时，在实验最后加进一针对操作过程： 1、 开机操作：（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）； （2）、自上

15、而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）； （3）、打开冲洗泵头的10异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准； （4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液； （5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。 2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命； 3、 建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果； 4、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡； 5、 溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤； 6、 实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30