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1、第二章：植物组培培养快速繁殖目的要求：1.掌握组织培养实验室的设计；掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；2.掌握培养基的种类、特点；掌握基本培养基的配方；一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；熟练掌握培养基的灭菌方法；一般掌握培养基的筛选办法。3.了解组培快繁的类型，重点掌握无菌培养物的建立。4.掌握植物组培快繁中常见问题的解决措施。教学重点、难点：基本培养基的配方；培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；培养基的灭菌方法；培养基的筛选办法。第一节 植物组培快繁的工厂化生产设施在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件
2、有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，首先需要一定的设备、器材和用具。一个标准的组织培养实验室应当包括：普通实验室（洗涤室、培养基配制室）、无菌接种室、恒温培养室、观察培养情况并作记录的细胞学实验室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。实验室的大小和设置可根据自己的工作性质和规模自行设计，其中最主要的是无菌操作室和恒温培养室。一、植
3、物组培快繁场地设计（一）组培快繁场地的选择无菌环境，周围安静、无污染，阳光充足，无高大建筑物遮挡，交通便利。（二）组织快繁厂房的设计1.药品贮藏间面积1015m2，需终年保持相对较低的温度和较好的通风干燥条件，同时需要遮光。2.药品配制间面积15m2左右，需抗盐酸、牢固、平稳，具有较好抗震性的试验台。3.玻璃器皿洗涤间（cleaning room）面积20m2左右，本室主要用于组织培养所需玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。4.培养基制作间面积
4、3m2培养基配制室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。为完成培养基的制备工作，该室还应配备以下仪器设备：1）大型工作台：其高度应方便配制工作。2）药品柜：用于放置常用药品。3）普通冰箱：主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。4）电子分析天平和托盘天平 电子分析天平：用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。5）电蒸馏水器 电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配制培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的
5、话，则须用蒸馏水。6）磁力搅拌器 磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。7）恒温水浴锅恒温水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。 8）电炉或电饭锅 电炉的功率为1500或2000W，并配有铝锅。电饭锅的功率1000W，用于琼脂的溶化。9）酸度计 组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水
6、冲洗净，盖上电极帽。 10）培养基分装设备小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用“下口杯”作为分装工具，在“下口杯”的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非常合适。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。11）烘箱 用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80-100；进行干热灭菌需保持150，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80烘干至完全干燥为止。12）盛装器皿用于药品的溶解、贮备、熔化等，如烧杯、试剂瓶等。13）计量器皿母液的配制、药液的分装、吸取等，如10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml
7、、1000ml的量筒，25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml、2000ml的容量瓶，0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、5ml的移液管。14）过滤器械如细菌过滤器，用于不耐高温物质（玉米素、吲哚乙酸、某些维生素等）的过滤。15）其他器皿滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常备器皿。5.消毒灭菌操作间面积在30m2左右，主要仪器有高压灭菌锅，用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。6.试管苗无菌转接操作间（transfering room
8、）接种室是进行植物材料的分离、消毒、接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般40-50m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。除通风口、入口外，均应密封。配置拉动门，以减少室内外空气的对流，污染室内环境。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。接种室应设有缓冲间，面积2m2为宜。室内放置有工作服、工作帽、拖鞋等物品，进入无菌操作室前在此更衣换鞋。缓冲间可使工作人员进入无菌操作室之前有一
9、个过渡，最好安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌，以减少工作人员进出时带人接种室杂菌。工作前，工作台用2%的新解洁尔灭擦洗，无菌室内的紫外灯要照射20分钟，室内应定时用消毒药品消毒（每平方米需2毫升与过量的高锰酸钾混合产生的蒸汽消毒；70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘、消毒）。接种室的主要设备及用具有：1）接种箱 在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。2）超净台cleaning table3）解剖镜 解剖镜种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、
10、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。4）无菌操作用的器具按单人超净台上用量有：酒精灯1个；20-25cm长的医用镊子1把；4号解剖刀1把，解剖刀片若干；15cm医用剪1把；250ml广口瓶1只，内放酒精，用于浸泡镊子、刀、剪等；用于架放灼烧过的刀、镊子的小架。 7.试管苗无菌培养间（culturing room）培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜
11、，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。每层上方装有24支日光灯管，灯管距上层隔板约46厘米，灯管间距20厘米，此时光强度最大可达2000lx3000lx，能够满足大多数植物的光照需求。培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右，室内要备有产热装置、安装窗式或立式空调机，以调节室温。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室
12、。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%-80%为好，可安装加湿器。光照是植物生长必需的条件之一。室内必备有光照设备，可安装定时开关钟以控制日光照时间。一般需要每天光照10-16h也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照 植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。（三）试管苗驯化移植大棚1.日光温室2.智能型连栋式温室二、植物组织快繁应用的设备和仪器（一）主要仪器设备1.超净工作台cleaning table优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短
13、。开机20分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于0.3um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。超净台分水平式和垂直式二种型号。 2.空调机3.除湿机4.恒温
14、培养箱供光照培养所用。多用于外植体的分化培养和试管苗生长之用。有可调湿与不可调湿种。条件许可的话还可以采用程控全自动调湿调温控光的人工气候培养箱，来进行植物组培和试管苗繁殖。5.干燥箱6.高压蒸汽灭菌锅用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒等。其种类有：大型卧式、中型立式、小型手提式、电脑控制型等多种型号，可根据自己的工作规模和经济实力适当选用。一般实验室中常用小型手提式蒸汽灭菌锅。7.冰箱8.天平用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。9.显微镜10.水浴锅1
15、1.摇床与转床在进行液体培养时，培养材料侵入培养液中，会引起氧气供应不足。为改善通气条件常用摇床或旋转床。前者作每分钟120次的水平往复式振荡，以促进培养液溶解空气，同时培养材料的上下翻动可以消除植物的相中例行。如在兰花组培时，利用摇床可以是兰花的原球茎得以快速繁殖。旋转床可以使固定在其转盘上的培养物作每分钟360度的旋转，使其上下沉浮，以增加其与空气的接触机会。12.酸度计（二）小型设备及器皿1.试管苗培养瓶在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放人培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。最常使用的是三角瓶，规格有l00ml，250ml，500ml等，一般使用l00ml三角瓶，无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小，亦不易污染。培养皿常用9、12cm直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。 试管常用18mml80mm或20mm200mm规格。可用于培养较高的试管苗，另外也不易污染。培养器皿还可就地取材，采用一些
