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1、实验生物学考试部门：研发 姓名：王晓婧8叶敏 设计一个制作抗小分子多肽单克隆抗体的流程用杂交瘤技术制备抗小分子多肽单克隆抗体的主要步骤如下（示意图见下图）：1、获得免疫的 B 淋巴细胞 用此小分子多肽作为抗原注射进小鼠体内，使其淋巴细胞产生相应的抗体。对小鼠做三 次免疫，并在取其脾脏的前三天做一次加强免疫，可使得到的抗体亲和力较好，此过程中不 用分离脾脏中的B细胞和T细胞，因为与骨髓瘤融合的过程本身就是一个选择B细胞的过程。取与免疫小鼠同系的小鼠的骨髓瘤细胞，可用不分泌型和酶缺陷型，现多用酶缺陷型， 缺乏TK （胸腺嘧啶核苷激酶）和HGPRT （次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶）。2、融合可用化学
2、融合法和电融合法等。常用的化学融合剂为PEG （聚乙二醇），其分子量越大， 融合率越高，但同时毒性也越强，故用作细胞融合剂的 PEG 一般选用分子量为 4000 及以下 的，在pH8.0pH8. 8左右的碱性环境中。电融合用电脉冲，无毒且融合率也高。3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用 HAT 选择性培养基（培养基中 加次黄嘌吟HyPoxan thine H,氨基喋吟Aminoop terin A及胸腺嘧啶Thymidine T）。在HAT 培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏TK和HGPRT,不能利用补救途径合成DNA,而只能利 用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这
3、一途径又被氨基喋吟所阻断，故不可避免的要死亡。停用 HAT 培养基后，用 HT 培养基。未融合的 B 细胞和 T 细胞在正常培养的情况下都会 自然消亡。这样，只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了 TK和HGPRT，并具有骨髓瘤细胞能 无限增殖的特性，因此能增殖。4、筛选在 HAT 培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞， 因此必须进行筛选。常用酶联免疫吸附测定（ELISA），筛选出能产生所需单克隆抗体的阳 性杂交瘤细胞。5、克隆化对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制。常用的克隆化方法有有限稀释法和FACS（荧光激活分选仪）分离法。6、大量繁殖单克隆抗体的大量制备可用体外培养法和腹水法。克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。 不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制，取同系小鼠，先在其腹腔注入降植烷进行预 处理，12周后腹腔注入杂交瘤细胞，一周后有明显腹水产生。用这种方法制备的腹水抗 体含量高，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。11杂交瘤细胞|细胞培养一 II选出所需要的细胞群 継续培养体内培养从腥水中提取单克隆抗悴
