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1、前 言无论在发达国家还是在发展中国家，心肌梗死仍然是一类严重危害人类健康的医学急重症。依据卫生部流行病学调查，我国缺血性心脏病患者已超过2000万人，每年新发病人数大约有100 万人。据不完全统计，全球每年约有1700 万人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死，冠心病已经成为一项世界性公共卫生课题(1)。随着世界人口的老龄化，冠心病发病率仍在持续增高(2)。冠心病传统治疗明显提高了心肌梗死的生存率和生活质量，但死亡和致残时有发生，也是造成心力衰竭的主要原因；传统治疗方法包括药物治疗、血管介入成形术和外科血管搭桥术，这些方法目前对复杂病亦变仍难以奏效。复杂病变主要包括弥漫性小血管病变、
2、慢性完全性闭塞病变、多支血管病变、多次介入治疗或手术后血管闭塞等(3-5)。因此，亟需积极探索治疗心肌梗死这一临床急重症新的策略和方法。治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)为心肌梗死提供了全新的治疗策略。治疗性血管新生又称“分子搭桥术”或“生物搭桥术”， 是指采取一定措施通过促进缺血局部新生血管的生成，形成新的循环通路，完成心脏缺血区域的自我搭桥，从而改善心肌灌注和心脏功能(6)。目前治疗性血管新生主要包括蛋白治疗、细胞治疗和基因治疗。蛋白治疗因为蛋白在体内的半衰期短，需要持续注射，单次剂量较大时可能导致血流动力学紊乱等原因，使其应用受到限制。细胞移植的方法主要为
3、细胞异体移植和细胞自体移植，但也存在诸多问题，如：分子生物学作用机制、细胞来源的种类与保障、细胞移植数量与免疫反应等，也使得细胞治疗的应用受到限制。基因治疗是指把编码有促血管新生因子或血管新生调控因子的基因通过载体转染到宿主细胞，在体内翻译表达相应的蛋白，从而有效促进缺血组织的新生血管生长。多种血管生长因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)(7, 8) 、血管生成素(angiopoietin, Ang)(9)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)(10)等能诱导缺血心肌血管新生并改善心
4、脏功能。因此，基因治疗成为促血管新生的另一选择。成人体内的血管新生(neovacularization)包括两个过程，首先是原有的血管通过芽生的方式长出初级的血管网络，包括内皮细胞的增殖、迁移、管状结构形成以及细胞外基质的重构，这一过程称为血管生成(angiogenesis)(11-13)。随后，这一初级的毛细血管网被平滑肌细胞和周细胞等血管支持细胞包裹，逐步形成具有完整结构的动脉血管网络，称为动脉生成(arteriogenesis)(14-16)。在血管生成阶段起主要作用的因子称为促血管生成因子(angiogenic factor ）， 如FGF(fibroblast growth fact
5、or, FGF)和VEGF。在动脉生成阶段发挥主要作用的血管生长因子称为促动脉生成因子(arteriogenic factor)，如Ang-1 和HGF 等。其中，促血管生成因子VEGF 的研究最为广泛和深入，也是目前已进入临床试验阶段的血管生长因子(17)。VEGF 是一种糖蛋白，1989 年Ferrara 等(18, 19)首先纯化出来，人VEGF 家族由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 和胎盘生长因子(placental growthfactor, PLGF)组成(20-23)。VEGF-A 常称之为VEGF，其编码基因定位于第6 号染色体长臂，为单一基因，总长为1
6、4kb，含8 个外显子和7 个内含子。转录后，其mRNA 可剪接为7 种异构体，分别为VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189、VEGF206。VEGF 与其受体结合后发挥生物学效应。VEGF 受体(VEGF receptor, VEGFR)属于受体酪氨酸激酶超家族，是一种膜镶嵌蛋白。目前发现有五种VEGFR：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR- 3、neuropilin-1 (NP-1) 和neuropilin-2 (NP-2)(24)。VEGF165 是VEGF 家族中研究最多最具特征性的促血管生成因子，主要与VEGFR-1、V
7、EGFR-2 结合后发挥作用，介导一系列细胞行为，包括细胞迁移、存活、增殖等(24)。多个研究表明，VEGF165具有促进血管新生、抗细胞凋亡等作用，其在缺血心肌的过表达能够改善心脏功能和心肌灌注(25-28)。Ang 及其受体是二十世纪九十年代中期发现的血管生成调节因子。Ang 家族有四个亚型：Ang1、Ang2、Ang3、Ang4，其受体为Tie1 和Tie2(29-34)。其中对Ang1 研究最为广泛和深入。Ang1 的基因位于8q22-q23，cDNA 编码498 个氨基酸。Ang1 分子量70kD，是由三个结构域组成的糖蛋白：N-端信号肽、第100-280 氨基酸组成的螺旋-螺旋结构
8、域(coiled-coil domain)和羧基末端的纤维蛋白原样结构域(fibrinogen-like domain, FD)(30)。螺旋-螺旋结构域与形成同源多聚体有关；FD 具有高度的保守性，存在于所有Ang 中，可能与Ang 和受体的结合功能有关(35)。Ang1 主要由血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和血管周围细胞分泌，Ang1 主要在胚胎期血管间质和成人的肺、冠状动脉、皮肤、肌肉、子宫内膜、卵巢、前列腺等组织中表达(36)。Ang1 激活其受体Tie2，对血管的生成、血管内皮细胞(vascular endothelial cel
9、l, VEC)的稳定和血管的重塑起调节作用(29, 37, 38)。虽然VEGF165和Ang1 都是促血管生成因子，但两者的功能并不相同。VEGF对发育早期血管网的形成是必需的，Ang1 主要对血管的重塑和成熟起调节作用。由于VEGF 具有很强的促进血管通透性的作用，因此也被称为血管通透因子（vascular permeability factor, VPF），常引起血管渗漏和组织水肿，而Ang1 有助于新生血管的成熟和稳定，可防止由VEGF 引起的血管渗漏和组织水肿（见下图）(39-42)。虽然缺血性心脏病生血管因子的基因治疗研究成果令人鼓舞，但仍存在诸多问题，如基因转导和表达的低效率、载
10、体引起的免疫反应、未调控的生血管因子过度表达以及心脏外脏器血管的新生等，尤其是未经调控的生血管因子过度表达以及心脏外脏器血管的新生大大降低了缺血性心脏病生血管因子基因治疗的安全性。为了提高缺血性心脏病生血管因子基因治疗的安全性，目前主要通过以下两种方法控制心脏外脏器血管的新生：（一）改善传递途径。心肌局部注射，直接将生血管因子注射到心肌缺血区有助于提高转导浓度，减少生血管因子在心脏外脏器的作用。但是，通过改善传递途径还无法完全调控生血管基因特异表达在缺血心肌。因此，必须进一步改善对基因表达的调控。（二）选择组织特异性启动子。目前研究表明，有一组启动子具有一定的心脏特异性，如巨细胞病毒(cyto
11、megalovirus, CMV)、结蛋白(desmin, Des)、-肌球蛋白重链(alpha-myosin heavy chain, -MHC)、心脏肌钙蛋白-C(cardiac troponinC, cTnC)启动子。CMV启动子表达在除肝脏以外全身所有脏器；Des启动子组织特异性分析表明，其除特异表达在心脏外还表达在小脑、子宫内膜、骨骼肌和侧脑室；-MHC、cTnC启动子在心肌和骨骼肌都有表达(43, 44)。虽然上述四种启动子具有一定心肌特异性，但仍不能避免生血管因子在心脏外脏器的表达。因此，寻找具有心肌特异的调控序列或启动子，已成为生血管基因治疗缺血性心脏病新的研究热点。新近研究表
12、明，MLC-2v启动子可调控目的基因特异表达在心肌组织(45)。MLC-2v启动子虽可调控生血管基因特异表达在心肌组织，但在治疗缺血性心脏病时，除调控生血管因子在心肌特异表达外，还期望生血管因子仅仅表达在心肌缺血区而不表达在正常心肌，因此需要进一步调控生血管因子在缺血心肌的表达。对生血管因子在缺血心肌表达的理想调控是对缺氧的反应，缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)是哺乳动物关键转录因子之一，在缺氧条件下被上调，并且通过与缺氧反应元件(cis-acting hypoxia-responsive element,HRE)结合调节基因表达。HRE在
13、促红细胞生成素(erythropoietin，Epo)和其它几个基因的5或3侧翼区，它的核心一致序列是(A/G)CGT(G/C)C，来源于Epo的HRE已经被用来调节自杀基因和凋亡基因在缺氧肿瘤内的表达(46)。Hua Su曾用Epo来源的HRE调节VEGF的表达，无论是在低氧与缺氧的心肌细胞还是在缺血性心肌组织，HRE都能诱导调控VEGF表达在缺血区(47)。生血管基因治疗常用的载体有非病毒载体和病毒载体。非病毒载体最常用的是质粒，将携带VEGF的质粒肌肉注射到患有周围血管病的动物和患者体内，有明确治疗效果(48-50)。但质粒载体在心肌的转导效率只有0.1-1%，这种低下的心肌转导效率使得
14、质粒的应用受到限制(51)。常用的病毒载体包括腺病毒和腺相关病毒等。腺病毒介导生血管基因能够提供高水平心肌转导效率和表达水平(7, 52-54)。然而，这种高水平的基因表达在具有免疫活性的宿主体内是短暂的。腺病毒载体有直接的细胞病变效应，能够引起宿主对病毒的免疫反应从而导致心肌的炎症反应(55-57)。与之相比，腺相关病毒载体(Adeno-associated viral vectors, AAVs)介导生血管基因治疗冠心病具有以下优点：无炎症反应：AAVs是非致病性载体(58-61)，不会引起炎症反应(62, 63)。作用时间长：当注射AAVs到骨骼肌，其携带的分泌性蛋白基因，如红细胞生成素
15、(64, 65)和因子IX(66)，能在动物体内多年维持治疗水平(67)。如AAVs能将其携带的生血管基因有效转入心肌细胞，将为缺血性心脏病生血管基因治疗提供新的载体工具。已有研究表明，AAVs直接心肌注射能有效转入心肌细胞(68, 69)。Hua Su曾比较携带VEGF的AAV1、AAV2、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5的表达时间，发现AAV1较其他五型载体表达VEGF时间更早，对梗死心肌的治疗效果更好(70)。传统用于建立急性心肌梗死模型的动物包括啮齿类、兔和犬等，这些动物的冠脉解剖结构变异性较大，且存在先天性的侧支循环网络，这与人类的解剖特点有很大的差异。小型猪因为其冠脉循环的解
16、剖、生理特点与人类非常相似，成为目前研究缺血性心肌病比较理想的研究模型。综上所述，AAV1是用于治疗心肌梗死较理想的载体；VEGF165和Ang1都能促进血管新生，Ang1能防止由VEGF165引起血管渗漏和组织水肿，VEGF165和Ang1具有协同作用；MLC-2v启动子能调控基因特异表达在心肌，HRE调控基因特异表达在缺血组织。由此提出如下假说：AAV1作为基因载体、使用250bp MLC-2v启动子和9个重复的HRE序列调控VEGF165和Angl在缺血心肌的特异表达，降低在心脏外组织和器官的表达，减少其副作用；同时使用VEGF和Ang1，利用两者的协同作用，提高治疗效果。为验证这一假说， 使用中华小型猪建立心肌梗死动物模型， 构建250bp MLC-2v 启动子和9个重复HRE 序列的两个AAV1 表达载体系统：AAV1-MLC -VEGF165和AAV1-MLCAng1，将两个AAV1表达载体系统通过心肌局部注射方法注射至梗死心肌组织周围，
