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1、高压液相色谱(HPLC)基本概念和理论一、基本概念和术语1. 色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测 器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线 (elution profile)。基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)-基线信号的波动。通常电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色 谱柱被污染所致。漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起， 柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂 移。色谱
2、峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号 产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近 似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对 称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰 (tailing peak)。前者少见。拖尾子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对 称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称子(asymmetry factor)。中国药典规定T应为 0.951.05。TV0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。峰底-基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peak height, h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽(pe
3、ak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切 线与基线的两个交点间的距离。W = 4a半峰宽(peak width at half-height, Wh/2)-峰高一 半处的峰宽。 Wh/2= 2.355a标准偏差(standard deviation ,a)-正态分布曲线x =1 时(拐点)的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的 0.607 倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱 过程中的分散程度a小，分散程度小、极点浓度高、 峰形瘦、柱效高；反之，a大，峰形胖、柱效低。的面积。峰面积（peak area , A）-峰与峰底所包2. 定性参数（保留值）死时间（dead time , t0）-不
4、保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相 HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积（dead volume , V0）-由进样器进样口到检 测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括 4部分： 进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被 流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池 体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分 只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽 量减小。V0 = Fxt0（ F为流速）保留时间（retention time , tR）-从进样开始到某个 组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积（retention volume ,V
5、R）-从进样开始到某 组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称 洗脱体积。VR = FxtR调整保留时间(adjusted retention time , tR)-扣除 死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reducedretention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时， tR 只决定于组分的性质，此，tR （或tR）可用于定性。tR = tR-t0调整保留体积(adjusted retention volume , VR)- 扣除死体积后的保留体积。3. 柱效参数理论塔板数(theoretical plate number, N)-用于定 量表示色谱柱的分离效率（简
6、称柱效）。N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所 用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分 含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰 高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和 常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾 的峰。N 与柱长成正比，柱越长， N 越大。用 N 表示柱效 时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为 1米时的 理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间(tR)计算理论塔板数，所得值称 为有效理论塔板数(N有效或Neff)。理论塔板高度(theoretical p
7、late height ,H)-每单位 柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数 计算。4. 相平衡参数分配系数(distribution coefficient，K)-在一定温度 下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流 动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有 关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中， K 有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为 渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样 品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的 性质，而与浓
8、度无关。这只是理想状态下的色谱条件， 在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱 内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下 样品中K值大的组分在固定相 中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留 时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性 质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及 pH 值，以获得组分间的分配系数差
9、异及适宜的保留时间， 达到分离的目的。容量因子（capacity factor, k）-化合物在两相间达 到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停 留的时间（tR）是不保留组分保留时间（tO）的几倍。k = 0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不 保留,tR = 0 ;k越大，说明固定相对此组分的容量越 大，出柱慢，保留时间越长。容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、 流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无 关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于 tR、 t0 较 Vs、 Vm 易于测
10、定，所以容量因子比 分配系数应用更广泛。选择性因子(selectivity factor ,a)-相邻两组分的分 配系数或容量因子之比。a又称为相对保留时间(美要使两组分得到分离，必须使a=1a与化合物在 固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、 流速、填充情况无关。从本质上来说，a的大小表示 两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。5. 分离参数分离度(resolution , R)-相邻两峰的保留时间之差 与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分 离程度。R=。当W1=W2时,R=。当R=1时， 称为4o分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%
11、, 内侧峰基重叠约2%o R=15时，称为6o分离，裸露 峰面积为99.7%。R21.5称为完全分离。药典规定R应大于1.5o提高分离度有三种途径：增加塔板数。方法之一 是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更 好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。 当a = 1时，R = 0，无论柱效有多高，组分也不可能 分离。一般可以采取以下措施来改变选择性： a. 改变 流动相的组成及pH值;b.改变柱温;c.改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法,可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R 也趋于0 ; k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而
12、且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在110范内，最好为 25，窄径柱可更小些。二、塔板理论1塔板理论的基本假设塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力 学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱 柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分 在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设 为：1) 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔(即 塔板高度)内完全服从分配定律，并很快达到分配平 衡。2) 样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向 的扩散可以忽略。3) 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个 塔板体积。4) 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。虽然
13、以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是 一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴 方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱 流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度 极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面 积 A）由色谱流出曲线方程可知：当t = tR时，浓度C有 极大值。Cmax就是色谱峰的峰高。因此：当实验 条件一定时（即o定），峰高h与组分的量CO （进 样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。当进样量一定时，or越小（柱效越高），峰高越高, 因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。由流出曲线方程对V（0求积分，即得出色谱
14、峰面积A。可见A相当于组分进样量CO此是常用的定量参数。把Cmax = h和Wh/2 = 2.355o代入上式， 即得A=1.064xWh/2xh此为正常峰的峰面积计算公 式。三、速率理论（又称随机模型理论）1液相色谱速率方程1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理 论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来， 提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。它把色谱 过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。后来 Giddings 和 Snyder 等人在 Van Deemter 方 程（后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与 气体的性质差异，
15、提出了液相色谱速率方程（即Giddings 方程）.2影响柱效的因素1 ）涡流扩散（eddy diffusion ）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A = 2入dp 0p为填料直径， 入为填充不规则因子，填充越不均勻入越大。HPLC常 用填料粒度一般为310pm，最好35pm，粒度分布RSDM5%。但粒度太小难于填充均匀（入大）,且会 使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易 填充规则均勻，入越小。总的说来，应采用细而均勻的 载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料,A = 0o2 ）分子扩散（molecular diffusion ）。又称纵向扩 散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致 轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u = 2y Dm/uo u 为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越 长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的 影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于 液相的 Dm 很小，通常仅为气相的 10-410-5，在 HPLC 中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略 不计。Y是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴 向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。
