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1、、制备胶体金的准备（一）玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内 不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色 或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流 水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾lOOOg，加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸 泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗34次，自来水冲洗掉洗洁剂， 用蒸馏水洗34次，再用双蒸水把每个器皿洗34次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处 理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经
2、制备的胶体金溶液，用同等大 不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这 样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。（二）试剂的配制要求按照 Frens 法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体 金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒 直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。 放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右
3、，仍保持稳定。（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸 水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全柠檬酸三钠还原法(Frens 1973 )此方法是由Frens在1973年创立的，制备程 序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCI4 溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1 %柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后 浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸710min出现透明的橙红色。各种颗粒的 胶体金制备详见表5-2。表5-2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系0.01%的 HAuCl4（ml）
4、1%柠檬酸三钠(ml)直径(ml)1005.010.01004.015.01001.525.01001.050.01000.7560.01000.6070.01000.4298.01000.32147.01000.25160溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。、制备胶体金的方法和步骤窄长型膜,依灵敏度及流速的要求,选用孔径不同的合适的膜.自下端至上端(由左至右)1. 样品垫(sample pad)2. 载有固相标记配体(抗体或抗原)的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条(con
5、juga te release membrane)3. 合适孔径的硝酸纤维素膜条(喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线,和阴性对照 组线)(ni-tr ocellulose mem tr ane)4. 吸水垫(absorbent pad)等四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上 (back sheet)胶体金快速斑点结合免疫分析随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业(diagnos tic industry),免疫分析向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维 膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂
6、盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远 离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”(real time clinical decision) 和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和 广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点 免疫结合分析(dot immunobinding assay, DIBA),始于80年代。现介绍如下：1 两种模式1.1 班点免疫渗滤分析(dot immunofiltrtion assay, DIFA)免疫反应是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤
7、维素膜而进行的(flow through t ype)。1.2 斑点免疫层析分析(dot immunochro-matography assay ,DICA) 分析原理与 DIFA 相同，只是反应液体的流动不是直向的穿透流动，而是层析作用的横向流动lateral flow type) ,在1990年开始应用。两种类型快速免疫分析比较见表。表 免疫渗滤分析和免疫层析分析的比较免疫渗滤分析(穿透滤过型)免疫层析分析(横向流动型)硝酸纤维素 膜的种类及 形式组成方 式为圆片膜孔径0.2-0.4如较简单，由载有配体(抗体或抗 原)的硝酸纤维素膜片及底层 的吸水垫料组成为窄长型膜，依灵敏度及流速的要求，
8、选 用孔径不同的合适的膜.自下端至上端 (由左至右)由：1. 样品垫(sample pad)2. 载有固相标记配体(抗体或抗原)的玻 璃纤维素膜条或聚酯膜条(conjuga te release membrane)3. 合适孔径的硝酸纤维素膜条(喷涂有 显示阳性结果的捕捉分析物的配体 线,和阴性对照组线)(ni-trocellulose memtrane)4. 吸水垫(absorbent pad)等四部分衔 接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上（back shee t）标记配体的形式为液相形式根据需要及可能可设计同时大多数为固相形式多功能性测定一种以上分析物加样、洗 涤、加标记同左操作步
9、骤配体及洗涤等步骤大多数只有加样一个步骤注:以上标记配体均为胶体金或硒标记、分散型染料标记等。如为酶标记则二者都必 须增加“加显色底物”的步骤2 标记物的种类标记物包括、胶体金属（胶体金，胶体硒）、分散型染料（disperse dyes）和染料 标记的微球（la tex par ticles ）等，标记物各有优缺点，可根据以下的标准选择，如：灵 敏度，所需要的颜色，分析的模式和操作步骤，制备、保证重复性、急定性及规模及的难易 程度和重复性，以及标记物所需配体量等。其中酶虽然有高灵敏度，重复性好及标记物易规 模化等优点，但它需要洗涤，加底物等步骤，需要反应的时间也长些，对技术也有一些要求， 故未
10、能作为快速诊断的主要标记物（1985年最初的免疫渗滤分析是以酶作为标记物）。目 前应用最广泛的标记物为胶体金，包括：胶体金免疫渗滤分析（gold immumofiltraition assay GIFA）或滴金免疫分析和胶体金免疫层析分析（gold immunochromatography assay , GICA）。由于GICA更简便快速，已成为目前最主要的快速免疫分析方法之一。3 原理胶体金免疫渗滤分析（GIFA）原理与操作步骤基本与ELISA相同：加样品于固定有 配体（抗体或抗原，此处以抗体为例，下同）的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体 -抗原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标
11、记抗体。当结果为阳性时，在膜上固定有 抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。胶体金免疫层析分析CICA原理与GIFA 相同，只是操作步骤有所不同，如反应液体流动方向由垂直渗滤改为横向层析流动（见表）： 样品加样品垫（1）上，样品向吸水垫（4）方向流动，途径载有固相胶体金标记抗体膜（2） 后，将金标记物完全复溶，抗原与金标记抗体形成金标记抗体-抗原复合物，继续向前流动 至硝酸纤维素膜条（3）上，固定有捕捉抗原的抗体线处。当结果为阳性时，金标记抗体- 抗原复合物上，就会形成金标记抗体-抗原-固相抗体复合物，呈现红色阳性条带；如样品中 无抗原，则不被捕获，就不显色，则结果为阴性。多余的游离
12、金标记抗体继续前移至固定有 抗金标记体二抗处，被固定呈现红色的阴性对照。GICA与GIFA不同之处在于后者只是单一 的免疫层析条，不需要其它试剂，一步操作。二者与ELISA不同处是反应时间大大缩短，仅 需要数分钟就完成了 ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗 体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧 密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓 缩作用（immunoconcen trai ton）。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐 与吸附在固相表面的抗体结合。同时
13、，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原- 标记抗体复合物，故需时间较长。4 胶体金块快速免疫结合分析的应用 应用领域很广，可分为临床应用与非临床应用两类。目前应用多以前者为主。4.1 临床应用 已应用于临床的很多领域。由于目前它还是定性分析，故主要用以 检测正常体认中不存在的生物活性物质（如传染病的抗原及抗体），以及正常情况下体液中 含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。随着技术的进展，对某些可确定诊断的、有 正常上限值（cutoff）的生物活性物质也可进行检测。下面列出国内外已应用的项目。4.1.1 传染病 （1）各种病毒的相应抗原及抗体：各种病毒性肝炎、巨细胞 病毒抗体，单纯
14、疱疹病毒抗体，风疹病毒抗体，肾综合症出血热抗体，登革热病毒抗体及轮 状病毒等；（2）性病：爱滋病病毒抗体，梅青螺旋体抗体，淋球菌及泌尿生殖系统的衣原 体等；（3）细菌：结核杆菌抗体，A族乙型溶血链球菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌抗体等；（4）寄生虫：疟原虫，血吸虫抗体，包囊虫抗体，弓形虫抗体等。4.1.2 激素 目前用于生殖标志物，主要有诊断早早孕的人绒毛膜促性腺激素 （HCG）和检测排卵的促黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）等。4.1.3 心血管病 急性心肌梗死的标志物，包括肌酸激酶的同工酶CK-MB,肌 红蛋白，肌钙蛋白-T及脂肪酸结合蛋白质（PABP）等。还有与心血管疾病有重要关系的D
15、- 二聚体（D-dimer）的检测。4.1.4 肿瘤 包括对肿瘤进行筛查和早期诊断有意义的肿瘤标志物，如前列腺特异抗原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜 血免疫检测（FOB）等。4.1.5 自家免疫病 抗双链DNA抗体和诊断甲状腺自家免疫病的甲状腺过氧 化物酶（TPO）抗体。4.1.6 毒品 检测尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。国外报 道有可同时测 7种毒品的 GICA。4.1.7 其它 检测C-反应蛋白，半定量检测血清a-脂蛋白。4.2 非临床应用 可用于食品检测，环境污染，生物沾染，还可用于生物战剂的快 速检测，兽医学及法医学等方面检测。5 制作及操作中需注意的问题以GICA为例，它将几种组分优化组合成一个整体的免疫层析分析条，许多条件及条 件的组合都会影响到它的质量，包括：（1）硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径大小及均一性，选定膜孔径的适宜性，结合配 体（抗原或抗体）容量的大小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速 度的均一性等；（2）捕捉配体的量及质量（配体的纯度，亲和力及滴度）及在膜上配体的包被量和均一 性。配体划线位置的固定一致性；（3）固相金标记膜中的胶体金和配体的含量和比度，条间的均一性，固相标记物的稳定 性，复溶性，复溶速度及流动性，所含
