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1、体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50L以下处理：(1)无菌水，对照；(2)浓度为lOOOpg/mlGAg；(3)浓度为1x104spores/mlPexpansum抱子悬浮液；(4)浓度为1000g/mlGA3+浓度为1x104spores/mlPexpansum抱子悬浮液。处理后湿纱布覆盖并用PE塑料膜密封作保湿处理。贮藏于常温(20-25C)下。分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10mL冷(4C)的50mmol/L磷酸缓冲液(PBS)内含1.33mmol/LEDTA和1%PVPP缓冲液(pH7
2、.8)。研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000gg/mL的原液。8.1.2蛋白试剂考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%(W/V)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。8.1.3 乙醇；磷酸(85%)。试验方法:分别取牛血清白蛋白标准溶液(1000gg/mL)0,、10pL、20pL、40pL、60pL、80pL、100g
3、L，无菌水补至100gL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液(试验7中得到)400此加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。9.1.2 Na2HPO4-12H2O；NaH2PO4-2H2O。9.1.3 磷酸缓冲液PBS配制母液：0.2MNa2HPO4:称取71.6gNa2HPO4-12H2O，溶于1000ml水；0.2MNaH2PO4:称取31.2gNaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水。按表2酉己制0.2M的PB(mL),最后稀释至所要的浓度表1
4、不同pH值PBS的配制pH6.47.07.80.2MNa2HPO4(mL)26.56291.50.2MNaH2PO4(mL)73.5388.59.2 试验仪器9.3.1 200yL、lOOOyL移液枪，eppendorf；9.2.2 酶标仪，；9.2.3 酶标板，JETBIOFIL9.3 试验方法9.3.1超氧物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活性的测定SOD采用氮蓝四唑(nitro-bluetetrazolium，NBT)法(Beauchamp和Fridovich，1971)。反应步骤为：取200卩1粗提液，加入3.7mlNBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓
5、冲液(PBS)配制的含77.12卩mol/L氮蓝四唑,lOOymol/LEDTA-Na?和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液,在30C下保温2分钟后加入100卩1核黄素溶液(PH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2卩mol/L核黄素和100卩mol/LEDTA-Na2),在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400此。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50%为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD总活性二(Ack-AE)xV/(Ackx0.5xWxVt
6、)式中，Ack为照光对照管的吸光度；Ae为样品管的吸光度；V为样品液总体积(ml)；Vt为测定时样品用量(ml)；W为样品鲜重(g)或蛋白质含量(mg)。9.3.2过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性测定CAT活性参照Aebi(1984)7的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400此。400此反应液含50mmol/L的PBS(pH7.0),30mmol/L的巴02和50卩L粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25C,pH7.0条件下1分钟分解lgmol过氧化氢所需酶量，结果以
7、U/mg蛋白或U/g鲜重表示。9.3.4多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)活性的测定PPO活性测定采用邻苯二酚法(Aquino-Bolanos和Mercado-Silva,2004)8o用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400卩L。350卩L反应液(用50mmol/L,pH6.4的PBS配制，内含100卩mol/L邻苯二酚)中加入50gL的粗酶液平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。9.3.5过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性测定POD活性测定采用愈创木酚
8、法（Lurie等，1997）9。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400卩L。反应体系为30此粗酶液，290gL0.3%愈创木酚（用50mmol/L的PBS酉己制，pH6.4）和80gL0.3%H2O2（用50mmol/L的PBS酉己制，pH6.4）。反应在加入H2O2后开始准确记时。连续吸光度在470nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。体系二SA对苹果果实抗性相关酶活性的影响用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。每个伤口处等量（30卩1）加入（1）SA溶液（10卩g/m1）；（2）酵母悬浮液（108cells/ml
9、）；（3）用SA溶液（10yg/m1）配制的酵母悬浮液（108cells/ml）；（4）无菌水（作为对照）。处理后贮藏于常温（20C），并用PE塑料膜密封作保湿处理。定期取样对组织酶活性和蛋白质含量进行测定。取样时先用无菌刀片表皮组织，然后用打孔器分别在伤口处和离开伤口组织5mm位点取样。每个处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次。2.7.3 SA对梨果实POD活性影响完好的果实在SA（100卩g/ml）溶液中浸泡10分钟后贮藏于常温（20C）,然后定期取样对组织POD活性进行测定。以无菌水处理的为对照。提取时先用刀片削去表皮组织。每个处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次
10、。2.7.4 酶提取和测定的程序1克果实组织加入10ml冷（4C）的50mmoll-1磷酸缓冲液IPBS内含1.33mmol打EDTA和1%PVPP缓冲液(pH7.8)。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织,然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量按Bradford(1976)的方法进行。2.7.5超氧物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活性的测定SOD采用氮蓝四唑(nitro-bluetetrazolium，NBT)法(Beauchamp和Fridovich，1971)。反应步骤为取200卩1粗提液加入3.7mlNBT反应
11、液50mmol/lpH7.8的磷酸缓冲液(PBS)配制的含77.12卩mol/1氮蓝四唑，100ymo1/1EDTA-Na?和13.37mmol/l甲硫氨酸溶液，在30C下保温2分钟后加入100卩1核黄素溶液(pH7.8的50mmol/l磷酸缓冲液中含80.2卩mol/L核黄素和100mo1/1EDTA-Na?),在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。(用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400卩1，下同)酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50%为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD总活性二(A
12、ck-AE)xV/(Ackx0.5xWxVt)式中，Ack为照光对照管的吸光度；Ae为样品管的吸光度；V为样品液总体积(ml)；Vt为测定时样品用量(ml)；W为样品鲜重(g)或蛋白质含量(mg)。2.7.6过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性测定CAT活性参照Aebi(1984)的方法进行测定。3ml反应液含50mmol/l的PBS(pH7.0),30mmol/l的H2O2和50gl粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25C，pH7.0条件下1分钟分解1gmo1过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋
13、白表示。2.7.7过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性测定POD活性测定采用愈创木酚法(Lurie等，1997)。反应体系为200卩1粗酶液，2.2ml0.3%愈创木酚(用50mmol/l的PBS配制,pH6.4)和0.6ml0.3%巴02(用50mmol/1的PBS配制，pH6.4)。反应在加入H2O2后开始准确记时。连续吸光度在470nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白表示。2.7.8多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)活性的测定PPO活性测定采用邻苯二酚法(Aquino-Bolanos和Mercado-Silva，2004)
14、。2.9m1反应液(用50mmol/l，pH6.4的PBS配制，内含100卩mol/l邻苯二酚)中加入100卩啲粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。2.7.9苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase,PAL)活性的测定PAL活性测定参照Camm和Towers(1973)的方法进行测定。1ml粗酶液中加4ml硼酸盐缓冲液(pH8.8)含10mmol/L苯丙氨酸；对照不加粗酶液，另加1ml蒸馏水。反应液在恒温水浴30C中保温0.5h后，测定290nm处吸光度。以每小时在290n
15、m处吸光度变化0.01所为一单位，结果以U/mg蛋白表示。2.7.10脂氧合酶(Iinoleate:oxygenoxidoreductase,LOX)活性的测定LOX活性参照Todd等(1990)的方法进行测定。反应体系为2.8ml反应液(用40ml浓度为0.1mol/lPBS内含200pl的Tween20和40pl的亚油酸，pH7.0)中加入200pl的粗酶液。平衡1分钟后连续测定234nm吸光度的变化。以1分钟内234nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。体系三（柑橘）1酶提取和测定的程序（SOD、POD、PPO、LOX）0.300g果实组织加入4.5ml冷（4C
16、）的50mmoll-i含I-33mmolLiEDTA和1%PVPPPBS缓冲液（PH7.8）。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，皮碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心10分钟。取上清夜作为酶活性等指标样品。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。1.1超氧物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）活性的测定SOD采用氮蓝四唑（nitro-bluetetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）反应步骤为：取200卩1粗提液，加入3.7mlNBT反应液（50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）酉己制的含77.12卩mol/L氮蓝四唑，100ymo1/LEDTA-Na?和1
