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1、本贴的目的：讨论目前审评尺度下，药品研发过程中，分析方法的验证项目及目的，试验方法，试验要求本帖仅仅针对于HPLC方法进行讨论方法开发的内容不在本帖讨论范围内1有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体）有关物质方法验证的前提条件：1. 各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离2. 根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。多波长检测（如有）则分别考察。3. 在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度4. 各杂质纯度已知5. 根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度6. 供试品溶解方法和提取方法得到合理证明1.1专属性：1
2、.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。1.1.2试验方法1.1.2.1定位试验：A. 目的对各已知杂质和主峰进行定位B. 试验方法：a. 配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为O.lmg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液b. 配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液c. 使用拟定分析方法分别进行定位。C. 试验要求：a. 空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点b. 定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定c.
3、分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）；1.1.2.2强制降解试验A. 目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。B. 试验方法对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析
4、，保证实验的意义即可。试验一般的范围为：强酸：0.15.0mol/LHCl溶液或视情况调节时间，温度，体积强碱：0.15.0mol/LNaOH溶液或视情况调节时间，温度，体积强氧化剂：30%的H2O2或视情况配制不同浓度的溶液或视情况调节时间，温度高温：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验光照：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验C.试验要求a. 一般样品含量控制在85%90%范围（归一化法），不一定要求每个条件都能降解出来。b. 在进行酸、碱、强氧化破坏试验时，每个试验最好都要做相应的空白（溶剂，空白辅料，复方制剂还包括除去某一主药的其他组分）破坏试验作为
5、辅助。c. 主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0（至少1.5）,已知杂质与相邻杂质分离度大于1.2d. 物料守恒，即未破坏主药的C/A与破坏后的C/A值相比，结果在0.91.1之间e. 关于破坏试验，更多内容请参阅lyslinjiu版主在帖子【讨论】2013-专属性实验（强制降解试验）2013-专属性实验（强制降解试验）-丁香园论坛f. 在此处做梯度时间（如有）延长验证试验。即将分析方法的梯度中，有机相比例最大的时长延长（建议延长时间为主峰保留时间或1020min）,考察是否降解出难以洗脱的物质在拟定方法的梯度周期内能有效检出。进一步考察分析方法的合理性1.2定量限1.2.1概念样品中
6、能被定量测定的最低量，有定量意义。1.2.2验证方法A. 目的考察杂质的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B. 试验方法配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。C. 试验要求定量限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/51.3检测限1.3.1 概念样品中能被检测出的最低量，仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。1.3.2验证方法A. 目的考察杂质的最低检出量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B. 试验方法配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为3时，得检测限。C.
7、试验要求检测限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/101.4溶液稳定性1.4.1 目的考察被测各溶液在特定时间周期内的稳定性1.4.2试验方法a. 配制系统适应性溶液、供试品溶液、对照品溶液，在室温条件下，分别在各时间点进样b. 如不稳定，需考察在低温条件下的溶液稳定性c. 时间范围根据试验需要来确定。比如做回收率中需要至少连续测定9份供试品，是所有单个验证项目中最长的，选择这个时间点是可以的。也有考虑到以后需要测定更多的样品，选择更长的时间范围。1.4.3试验要求a. 系统适应性溶液，各峰之间分离度应符合要求。b. 对照品溶液峰面积RSD应小于2.0%c. 供试品溶液，杂质个数和杂质量
8、应一致，峰面积RSD应小于5.0%；不得检出新增杂质d. 如不稳定，需临用现配或低温保存1.5仪器精密度1.5.1概念同一溶液，连续进样6次，其tR和峰面积的精密度，考察仪器的进样精密度1.5.2 试验方法配制限度浓度的各杂质和主成分的混合溶液，连续进样6次1.5.3试验要求a. tR的RSD小于2.0%b. 各峰面积RSD小于2.0%1.6线性与校正因子1.6.1概念在设计的范围内，被测物浓度与峰面积的线性关系1.6.2 试验方法配制各杂质和主成分的混合溶液，逐步稀释，浓度范围从定量限至限度浓度的120%以上，至少配制5份以上溶液。由2人分别进行。1.6.3试验要求a. 线性关系系数r大于0
9、.990b. Y轴截距应在100%响应值的25%以内c. 响应因子的相对标准差应不大于10%d. 2人测得斜率之比在0.981.02之间e. 计算出来的校正因子应进行修约，在0.91.1范围内的，修约为1.0进行计算；0.25.0范围内的，按校正因子计算；0.25.0范围外的，按外标法计算。1.7精密度1.7.1概念同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。1.7.2 重复性1.7.2.1 试验方法由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。1.7.2.2 试验要求a. 检出杂质个数，杂质相对保留时间，各杂质百分含量均应一致b. 单个杂质的百分含量的极
10、差应在其含量10%以内c. 杂质总量的RSD应小于5.0%1.7.3中间精密度1.7.3.1试验方法同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。1.7.3.2试验要求a. 同1.7.2.2-a和bb. 单个杂质和杂质总量的RSD应小于10.0%1.8回收率1.8.1概念用拟定分析方法所测得结果与真实值接近的程度。1.8.2试验方法a. 配制各杂质的混合贮备液b. 称取供试品适量，精密加入混合杂质贮备液适量，配制成溶液，使供试品浓度为测定浓度，杂质浓度分别为限度浓度的50%，100%，150%。各浓度均平行配制3份c. 配制混合杂质对照品溶液和自身
11、对照溶液1.8.3试验要求a. 各浓度下的回收率应在90%110%之间b. 回收率（N=9）的RSD应小于10.0%c. 用加校正因子的自身对照法计算结果应与杂质外标法计算结果一致1.9耐用性1.9.1 概念在拟定的分析方法有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的分析方法用于常规检测提供依据1.9.2试验方法a. 分析方法中可变动的因素有：流动相组成比例，水相pH,柱温，色谱柱（同一品牌不同批次，不同品牌的常用色谱柱），流速，检测波长b. 配制系统适应性溶液，供试品溶液，对照品溶液进行测定1.9.3试验要求a. 系统适应性溶液应符合规定；如不符合规定，则需更严格控制所变化的因素，直
12、至找到一个合适的范围;如指定色谱柱，严格控制pH等等b. 检测杂质个数，杂质的相对保留时间应与精密度结果一致c测得杂质量应与精密度结果一致2. 含量测定（适用于API，制剂，也适用于单个杂质控制）含量测定方法验证的前提条件：1. 空白（溶剂和辅料）和各杂质不干扰主峰的测定2. 根据主成分的紫外吸收波长（复方需分别单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。多波长检测（如有）则分别考察。3. 在检测波长下，计算S/N，预估主成分浓度4. 供试品溶解方法和提取方法得到合理证明2.1 专属性：2.1.1 概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定主成分的能力
13、。2.1.2试验方法2.1.2.1定位试验：A. 目的同1.1.2.1-AB. 试验方法同1.1.2.1-BC. 试验要求：a. 空白应和各杂质不得干扰主成分的测定，主峰保留时间处不得为梯度峰拐点（如有）b. 定位溶液中，主峰的峰纯度应符合规定c. 分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.02.1.2.2强制降解试验A. 目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对含量测定分析方法用于检查主成分的专属性进行验证。B. 试验方法同1.1.2.2-BC. 试验要求a.主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于
14、2.0其他同1.1.2.2-C2.2定量限2.2.1概念样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。2.3.2验证方法A. 目的考察主成分的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B. 试验方法配制检测浓度的主成分溶液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。C. 试验要求定量限浓度不得高（修正，原为低）于检测浓度的1/102.3溶液稳定性试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0%如溶出检测方法同含量，建议考察一个溶出曲线周期内的溶液稳定性其他同1.4项下2.4仪器精密度试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0%其他同1.5项下2.5线性与校正因子2.5.1概念在设计的范围内，被测物浓度
15、与峰面积的线性关系2.5.2试验方法配制主成分贮备液，逐步稀释，浓度范围从检测浓度80%至120%，至少配制5份以上溶液。由2人分别进行。2.5.3试验要求同1.6.32.6精密度2.6.1概念同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。2.6.2重复性2.6.2.1试验方法由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量。2.6.2.2试验要求6份供试品含量结果RSD应小于2.0%2.6.3中间精密度2.6.3.1试验方法同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量2.6.3.2试验要求a. 6份供试品含量结果RSD应小于2.0%b. 12份供试品含量结果RSD应小于2.0%2.7回收率2.7.1概念用拟定分析方法所测得结果与真实值接近的程度。2.7.2 试验方法a. API在精密度，线性和专属性推算出来
