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1、凯氏定氮法1. 原理蛋白质是含氮的有机化合物。含蛋白质物质与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白 质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫 酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。含氮量 *6.25=蛋白含量2. 试剂所有度剂均用不含氨的蒸馏水配制。(1)硫酸铜(CuSO45H2O)；( 2)硫酸钾；( 3)硫酸；(4) 硼酸溶液(20g/L)；(5) 混合指示液：1份(lg/L)甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚绿乙醇溶液临用时混 合。也可用2份(lg/L)甲基红乙醇溶液与1份lg/L次甲基蓝乙醇溶液，临用时混合。(6) 氢氧
2、化钠溶液(400g/L)；(7) 标准滴定溶液：硫酸标准溶液c(1/2H2S04)=0.0500moL心或盐酸标准溶液 c(HCI)=0.0500moL/L。3. 仪器定氮蒸馏装置如图所示。1 一电炉；2水蒸气发生器(2L平底烧瓶)；3螺旋夹；4 一小玻杯及棒状玻塞；5反应 室；6 反应室外层；7橡皮管及螺旋夹；8冷凝管：9 一蒸馏液接收瓶4. 操作方法(1) 样品处理：精密称取0.02-2.00g固体样品或2.00-5.00g半固体样品或吸取 10.00-20.00mL液体样品(约相当于氮30-40mg),移入干燥的100mL或500mL定氮瓶中， 加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20mL硫
3、酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45斜于 于小孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶 内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20mL水， 放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度， 混匀备用。同时做试剂空白试验。(2) 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约三分之二处，加甲基红指示剂数滴 及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸 气发生瓶内的水。(3) 向接收瓶内加入10mL 20g/L硼酸溶液及混合指示剂1-2滴，并使冷凝管下端插
4、入液 面下，吸取10.0mL样品消化稀释液，由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使流 入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞，将10mL 400g/L氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞, 使其缓慢流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小烧杯中，以防漏气，夹紧螺旋夹7,开 始蒸馏，蒸气通入反应室，使氨通过冷凝管而入接收瓶内，蒸馏5min，移动接收瓶，使冷 凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以硫 酸或盐酸标准溶液（0.05moL/L）滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时准确吸取10mL试剂空 白消化液按（3）操作。5. 计算X -（V1 V2）X c X 0.0
5、14 x F X 100 % m x 10式中：X-样品中蛋白质的含量，g/1OOg（g/1OOmL）；V1-样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积， mL； V2-试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积， mL c-硫酸或盐酸标准溶液的浓度， moL/L； 0.014-1C硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m-样品的质量（或体积），g或mL；F-氮换算为蛋白质的系数。6说明（1）样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样 消化不完全，结果偏低。（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢
6、加入30%过氧化氢（H2O2） 2-3ml,促使氧化。（4）在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部, 以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨 作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱 性反应的指示剂。（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。（8）氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸试馏出液
7、是否为碱性。（9）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算 时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。（10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格， 亦可免去用移液管，操作比较简便。（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的 硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生 成深蓝色的结合物Cu（NH3）42+(12) 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的 组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。
