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1、药学专业外语阅读 姓名：专业：药理学 指导老师：新型超分子物质2 轮烷对体外黑色素瘤细胞和结肠癌细胞中Caspase （半胱天 冬酶）信号转导通路的影响 摘要：我们研究了超分子物质2 轮烷（troa0001）对半胱天冬酶的信号转导和 癌细胞株的细胞活力的影响。tro-a0001抑制细胞增殖，并具有浓度依赖性。暴露 于troa0001的细胞其裂解形式caspase-3和PARP （腺苷酸二磷酸核糖转移酶）的 表达明显升高。经过tro-a0001的作用Bax的表达增加了。此外，通过siRNA下调 Bax蛋白表达导致显著的生长活化作用。形态学分析表明，tro-a0001增加了人类 癌细胞细胞株的细胞

2、凋亡水平。这些结果表明，tro-a0001可以诱导癌细胞凋亡， 有望作为一种新的潜在抗肿瘤药物。关键词：2轮烷，超分子化合物，细胞凋亡目前癌症在全世界上都是导致死亡的罪魁祸首。因此迫切需要开发抗癌药物。大部 分抗癌药物只有被癌细胞吸收才能发挥作用，而具有相对较低的分子量和稳定的结 构的药物可以很容易地在细胞膜上通过扩散系统或运输方式被细胞吸收。然而，抗 癌药物，很容易被吸收，也常常很容易从细胞中排泄，其作用可能不能得到有效控 制。同时他们的使用可能会伴随着严重的药品不良反应和多药电阻（1）。因此，一 个新的种子化合物对未来抗癌药物发展是必要的。我们已经合成了一种新型超分子 物质【2】轮烷（tr

3、o-a0001）（图1A），这是一个独特的缺少一个共价键（2-4）的 高分子化合物。在通过细胞凋亡来控制癌细胞的治疗中，普遍认为对线粒体介导的信号通路、 caspase-3和其他蛋白酶的治疗手段的关注是很重要的（5-7）。本研究的主要目的 是确定2 轮烷是否具有抑制癌细胞生长的生物活性，其机制是否与对caspase-3或 另一种蛋白酶的作用有关。目前2轮烷的研究中使用的是2 二（2 （3）乙基铵三氟甲磺酸二苯并-24-冠-8 轮烷（TRO-a0001）。a0001 TRO 和二（2 -3,5 乙基）三氟甲磺酸铵（nk7 40 2），后 者为前者轴的一部分，两者都是由日本高田实验室合成的（8）。

4、二苯并-24-冠8醚 构成a0001 TRO轮的部分，购买自东京化工实业（东京）。这些化学物质在DMSO （二甲基亚砜）中被溶解。这项研究中应用的细胞包括，人类的高加索人恶性黑色素瘤细胞株G361和人结肠癌细 胞系DLD-1（欧洲收集细胞培养，英国）,小鼠黑色素瘤B16细胞/ BL6,和鼠标直肠癌细胞 株Colon-26（发展研究所、衰老和癌症，东北大学，日本。这些细胞被培养于1640无血 清细胞冻存培养基中（美国生命科技），加入10%胎牛血清和青霉素（50单位/毫升），链霉 素（50 g / ml）。空气环境为含5%二氧化碳的潮湿空气。 对活细胞和其增殖的定量研究，我们用MTT法测定，并用酶

5、标仪分析结果（贝克 曼库尔特，USA）。细胞C5X103细胞/孔）被添加到96孔板中（50?L）加入含10% 胎牛血清的1640培养基中。培养12 h后，细胞用不同浓度的tro-a0001处理（2.5, 5, 10mol/L的TRO-a0001溶解于0.2%DMSO溶液。对照组用0.2%二甲基亚砜单 独处理。不同浓度的TRO-A0001给药后的活细胞数量根据吸光度与细胞数量的标 准曲线来计算。 免疫印迹法方法用于分析caspase-9, caspase-3, caspase-7,聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）,和Bax蛋白（抗体购自美国细胞信号技术公司）。给TRO24小时后的细 胞溶解产

6、物在4 C下离心15分钟（14000XG）,取上清液用于蛋白质样品。等量 的蛋白质样品（2.5?G ）由10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）分离，转移到聚偏二氟乙烯膜（美国Bio-Rad实验室）而得到。 Bax和非靶向控制小干扰RNA （siRNA）可通过细胞信号转导技术获得。细胞接种 于6孔培养板且在完全培养基培养24小时（60%-80%聚集）。培养后，在100 nm 制程控制和Bax siRNA下运用TransIT-siQUEST转染试剂进行细胞转染24 - 48小 时。转染细胞获得后，接种于96孔培养板测量细胞活力，如下所述。 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP -

7、end标记通道 测定凋亡细胞。我们用Click-iT Alexa Fluor 594染料末端标记法成像技术检查由TRO-A0001引起的细胞死亡。TUNEL- 阳性细胞和细胞核用hoechest 33342染料染成红蓝色。另一个对照组添加脱氧核糖 核酸酶。图像由荧光显微镜获得（基恩士公司，大阪）。 结果通过单方差分析，然后TK检验确定各组间的差异。所有的数据如果平均值土 SEM PV0.01被认为是有统计学意义的。 用tro-a0001处理48小时后，所有的肿瘤细胞株中活细胞的数量显著下降，并具有 浓度依赖性（2.5 - 10?M）（图1b）。G361用tro-a0001处理24小时后的IC5

8、0值是 2.58M。在 DLD-1 是 7.81 OM , B16/BL6 为 6.39M，在结肠-26 细胞少于 2.5OM（数据未显示）。细胞信号转导通路的半胱天冬酶的表达水平作为衡量细胞凋亡的标志。在实验中， 在所有的癌细胞中半胱天冬酶的表达水平都通过troa0001 （2.5 - 10?M）分别上调 caspase-3和PARP的裂解程度（图2A-D）。另一方面，全长caspase-3与对照样品 相比没有改变，而全长PARP在结肠癌细胞株内水平下降（图2：C,D）。全长caspase-3 在黑色素瘤细胞中的表达降低，全长PARP与G361细胞表达显著不同（图2： A, B）。这些结果表

9、明，tro-a0001通过激活凋亡通路来削弱核功能进而诱导黑色素瘤和 结肠癌细胞损伤或死亡。 Bax的表达水平作为通过线粒体途径诱导细胞凋亡的关键而被测量。与对照组相比，tro-a0001处理后的细胞Bax的表达水平增加。Bax增加膜的渗透性，从而导致 线粒体细胞色素C增加，活化caspase-9，激活caspase途径使细胞凋亡。与对照组 相比10.0-M浓度实验组使人类肿瘤细胞caspase-9水平显著降低，但在G361细胞 中caspase-9的表达水平显示不同结果（图2： A，C）。此外，Caspase-7表达水平 在每种细胞之间均不同。为证实下调Bax阻断tro-a0001诱导凋亡，

10、我们使用Bax siRNA转染方法并检测其对 细胞活力的影响。我们的研究结果表明，在用tro-a0001处理DLD-1，B16/BL6，和 Colon-26细胞36小时后，相比较对照组，Bax siRNA转染明显提高了细胞活力，虽然 G361细胞没有表现出显著的活力提高作用（图3A）。对于G361细胞，如图2A,在对 照组样品Bax表达水平极低（0 M）,因此我们认为在TRO-A0001处理下Bax siRNA 转染没有影响G361细胞的活性。综上所述，结果表明，在TRO-A0001诱导细胞凋亡 过程中下调Bax也是抑制细胞凋亡的一个原因之一。 TUNEL成像分析显示在经过tro-a0001处

11、理后凋亡细胞数量显著增加（图3b）。TUNEL阳性细胞数量要比经过tro-a0001处理后对照组中要高。 Caspase （半胱天冬酶）在调节细胞凋亡信号传输中扮演着重要的角色。半胱天 冬酶是作为相对不活跃的酶原被合成的，通过在细胞内的级联上游蛋白酶裂解。引 发剂半胱天冬酶能够裂解和活化下游的效应半胱天冬酶，如caspase-3, 6,和7, 最终导致细胞凋亡。细胞凋亡是细胞程序性自杀。细胞凋亡是通过死亡受体或线粒 体水平介导的，而且这两个系统都可以激活Caspase-3。 在这项研究中，tro-a0001引起的细胞死亡的特点是通过活化caspase信号通路实现 的（图。1B, 2）。活化的c

12、aspase-3导致PARP的蛋白降解，是引起细胞凋亡的原 因。PARP的裂解表明核DNA出现损伤，导致DNA碎片化并可观察到细胞凋亡的 特征性改变。PARP （116 kDa的）是一个核酶，有助于细胞维持其生存能力，所以 他们可以修复其DNA，而裂解PARP （89 kDa的）促进细胞裂解。我们对裂解C3 的表达分析表明，tro-a0001能活化caspase-3并向下游发出信号来调控PARP裂解。 裂解的PARP的表达在所有的癌细胞中均增加，引起细胞凋亡。 caspase-9和Caspase-7表达结果的不同可能是由于每个细胞株的不同性质引起的。 而且许多检TUNEL阳性细胞能在用tro-

13、a0001 （10?M）处理的人类黑色素瘤和结肠 癌细胞中检测到（图3b）。因此，通过tro-a0001处理后具有高水平caspase-3的细 胞表现出驱动细胞死亡的作用，细胞死亡的机制被认为是诱导细胞凋亡。此外，如 图3a所示，Bax抑制细胞活力明显增加，与通过tro-a0001诱导的抗增殖效应相比 较，DLD-1B16 / BL6和Colon-26细胞，表明siRNA有一种导致G361细胞复苏的 作用。 对暴露于troa0001各个组成要素，dibenzo-24-crown-8-ether和nk7-40-2没有影响 细胞活力（数据未显示）。这表明轮烷结构影响细胞了的生长。上述超分子物质存 在内部分子运动如量子轴上的穿梭运动。在RO-A0001作用下抗增殖作用可能参与 特定分子的行为。结论：2 轮烷，tro-a0001,能通过激活肿瘤细胞内caspase信号通路诱导细胞凋亡， 可能是一种有效的抗肿瘤的药物。