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1、上皮性卵巢癌组织P-gp、GST-、Topo-表达与ATP肿瘤体外药敏试验的关系【关键词】 上皮性卵巢癌（PEOC）,【摘要】 目的 探讨卵巢癌组织中耐药相关蛋白P-gp、GST-、Topo-的表达与ATP-肿瘤体外药敏试验（ATP-TCA）结果的关系。方法 采用ATP-TCA法对24例原发上皮性卵巢癌患者手术切除的新鲜癌组织进行体外药物敏感性测定，分别检测对泰素、顺铂、健择、阿霉素、拓扑替康5种化疗药物的敏感性。同时用免疫组化检测组织中P-gp、GST-、Topo-的表达。结果 24例上皮性卵巢癌手术标本中，ATP-TCA可评价率95.83%，所测标本对药物的体外敏感率依次为泰素91.30%
2、，健择86.96%、阿霉素65.22%、拓扑替康47.83%、顺铂21.74%，GST-蛋白阳性表达与卵巢癌组织体外对顺铂的耐药相关（P=0.037），P-gp、opo-蛋白阳性表达与卵巢癌组织体外泰素、健择、阿霉素、拓扑替康、顺铂的耐药均不相关，P0.05。结论 卵巢癌组织GST-蛋白表达与体外对顺铂的耐药相关，GST-阳性表达是否可以作为预测上皮性卵巢癌患者耐药的标志物，值得进一步扩大样本进行临床研究。关键词 P-gp GST- Topo- ATP-TCA 免疫组化SP法 上皮性卵巢癌（PEOC） The expression of P-gp，GST-and Topo-proteins i
3、n primary epithelial ovarian cancer and their relationship with ATP-tumor chemosensitivity assay. Gao Guolan，Qi Qingping，Zou Xuesen，et al. Department of Obstetrics and Gynecology，Jiangxi Cancer Hospital，Nanchang330029. 【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the three drug resis
4、tance-associated proteins P-gp，GST-，Topo-and ATP-TCA.Methods ATP-TCA was used to detect the sensitive rate of24specimens of fresh ovarian cancer tofive cytotoxic drugs as follows:paclitaxel（TAX），gemcitabine（GEM），doxorubicin（ADM），topotecan（TPT）and cisplatin（DDP）.Meanwhile，expressions of P-gp，GST-and
5、Topo-proteins were examined in paraffin-bedded sections from these24resected specimens by S-P immunohistochemical staining.ResultsEvaluable testresults were achieved in23of24specimens，the evaluability rate of ATP-TCA was95.83%.The ex vivo sensitive rate of TAX was91.30%，of GEM was86.96%，of ADM was65
6、.22%，of TPT was47.83%，of DDP was21.74%sequently.The expression of GST-protein was concordant with the resistance to cisplatin（P=0.037），but not with that to TAX，GEM，ADM and TPT.The expression of Q-gp and Topo-proteins was not associated with any resistance to DDP，ADM，TAX，GEM and TPT.Conclusion The po
7、sitive expression of GST-protein might be correlated with the resistance to cisplatin in PEOC.Further clinical studies in a large group of patients were needed forconfirmation whether GST-protein expression could become a useful marker to predict the resistance in epithelial ovarian cancer patients.
8、Key words P-glycoprotein glutathione S-transferase-pi topoisomerase ATP-tumor chemosensitivity assay S-P immunohistochemical化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。常规化疗仅凭经验用药，存在着盲目性，且化疗过程中易出现多药耐药（multidrug resistance，MDR），因此疗效不理想。一直以来，肿瘤学家们致力于通过体外药敏试验筛选敏感药物指导个体化治疗 1 ，同时从分子 水平探讨可能导致肿瘤耐药的原因，取得了一定的进展。但有关耐药蛋白表达与体外药敏关系的研究却鲜有报道
9、。笔者采用ATP肿瘤体外药敏试验（ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA），对24例原发上皮性卵巢癌患者手术切除的新鲜癌组织进行体外药物敏感性测定，同时检测P-gp、GST-、Topo-蛋白的表达，分析耐药蛋白表达与ATP肿瘤体外药敏结果的关系，旨在为临床预测耐药，指导个体化化疗药物选择提供实验依据。1 资料与方法1.1 一般资料 选择2002年8月2003年12月在江西省肿瘤医院妇产科住院手术的卵巢癌患者24例（病理学证实为上皮性卵巢癌，术前未行化疗），年 龄2276岁，平均51.6岁，肿瘤标本离体后立即取材，选择肿块边缘血供较丰富、细胞活性较好的部
10、分装入含有100U/ml的青霉素、100g/ml链霉素的MI1640的离心管中，即刻送我院肿瘤研究所进行ATP-肿瘤体外药敏试验，另取一部分标本10%甲醛固定，常规石蜡包埋备用。表1 24例上皮性卵巢癌临床病理资料 (略）1.2 抗肿瘤化疗药物 泰素（TAX）（美国百时美施贵宝公司）、顺铂（DDP）（冻干型）（山东德州）、健择（GEM）（法国Lilly公司）、阿霉素（ADM）（浙江海正）、拓扑替康（TPT）（江苏恒瑞）。用生理盐水配制化疗药物储存液:TAX6mg/ml、cDDP2mg/ml、GEM40mg/ml、ADM2mg/ml、TPT1mg/ml。TAX、cDDP、ADM40C保存。GEM
11、-200C存放，TPT-700C存放。文献 24 提供的血浆峰浓度（peakplasma concentration，PPC）:TAX13.6g/ml、DDP3.8g/ml、GEM25g/ml、ADM0.5g/ml、TPT0.75g/ml。1.3 主要试剂仪器 ATP-TCA核心试剂盒（德国DCS产品，购自深圳达科为生物技术公司）:包括完全分析培养基（CAM）、最大ATP抑制剂、组织消化酶液、ATP提取液、荧光素-荧光素酶（lulu）、Tris-Buffer、ATP标准品。MPL-自发光分析仪（德国erthold）、TC-2323CO 2培养箱（美国Shelton）。1.4 免疫组化染色 采用
12、微波炉煮沸脱交联SP法，操作按试剂盒说明进行。每批实验均用已知P-gp、GST-、Topo-阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。1.5 免疫组化结果判定标准 按文献报道 5，6 ，P-gp、GST-、Topo-分别以细胞膜、细胞浆、细胞核内是否出现棕黄染色颗粒判定阳性或阴性。P-gp定位于细胞浆和细胞膜，以细胞膜为主，GST-定位于细胞浆，Topo-定位于细胞核。阳性判断标准:每张切片分别由两位病理专家阅片，观察10个高倍视野，共计数1000个细胞，按阳性肿瘤细胞 占百分比计算，“-”为不染色，“”为10%，“+”为10%。将“-”和“”作为阴性表达，余定为阳性。1.6 ATP
13、-TCA操作步骤 （1）无菌条件下将肿瘤组织约1cm1cm1cm，充分剪切成小碎块，加入消化酶液，37孵育46h，期间每30min混匀1次。消化毕，细胞解离液过300目钢网，1500rpm，离心5min，用RPMI1640重悬备用;（2）2%台盼蓝染色观察细胞活性，并计数细胞数，用CAM稀释至1.52.510 5 个/ml;（3）将8000%PPC的各化疗药物于96孔细胞培养板内依次倍比稀释至6个梯度药物浓度（400%12.5%PPC，A-F行），每个浓度3复孔，每孔0.1ml。（4）各孔加入0.1ml肿瘤细胞悬液，无药对照孔（MO）（G行）加入0.1ml肿瘤细胞悬液和0.1mlCAM，ATP
14、最大抑制对照孔（MI）（H行）加入0.1ml肿瘤细胞悬液及0.1mlATP最大抑制剂，（5）于37，5%CO 2 ，95%湿度下培养6天后加入肿瘤细胞ATP提取液50l，混匀后室温下放置30min。（6）用自发光分析仪检测，DCS软件系统自动进行数据分析。计算各浓度下肿瘤细胞生长抑制（TGI），TGI=1-（有药孔-MI）/（MO-MI）100，敏感度指数（Indexsum=600-各个浓度的TGI之和）。1.7 ATP标准品的检测 ATP标准品生理盐水配成系列浓度:10 -5 、10 -6 、10 -7 、10 -8 、10 -9 、10 -10 mol/L，取50l各浓度ATP标准品加入荧
15、光-荧光素酶50l，快速混匀，每浓度3复孔。用自发光分析仪检测。以浓度对光脉冲数绘制标准曲线。1.8 ATP-TCA结果的评估 （1）所测标本须经细胞学和病理学证实为恶性肿瘤，细胞悬液中活细胞数80%，肿瘤细胞数20%，（2）培养过程中MO孔必须可观察，结束后检测值MO孔必须大于所有有药孔，ATP含量108mol/L。（3）3复孔间CV值20%。（4）ATP-TCA化疗药物敏感耐药判断以Indexsum300为敏感，300为耐药 4 。1.9 统计学方法 SPSS11.5软件处理数据，ATP标准品数据进行直线相关分析，并进行相关系数检验及配对t检验。P-gp、GST-、Topo-蛋白表达率和体
16、外药物敏感性的关系采用Fisher确切概率法分析。2 结果2.1 ATP标准品曲线 以ATP浓度（mol/L）的对数为横坐标，荧光值对数为纵坐标，绘制曲线，直线回归方程:Y=0.939X+10.842相关系数r=0.995，P0.001。平均变异系数CV=1.2%（0.7%8.5%），见图1。图1 ATP标准品曲线2.2 5种化疗药物体外药物敏感性试验结果比较 在收集的24例手术标本中，23例可评估，可评估率为95.83%（23/24），其中1例失败，为细菌污染，试验结果显示卵巢癌个体对不同化疗药物具有不同的敏感性，显示出肿瘤的异质性（图2，3，4）。在所测的药物中最敏感的为TAX，敏感率91.30%（21/23），其次为GEM86.96%（20/23），ADM敏感率为65.22%（15/23），TPT47.83%（11/23），DDP
