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1、. . 山东农业大学毕 业 论 文题目：辣椒内生拮抗菌的分离与鉴定 学 院 生命科学学院 专业班级 2013级生物工程 4 班 届 次 2017届 学生姓名 学 号 指导教师 二O一七 年 五 月 二十八 日装订线. . 目录中文摘要1英文摘要.11 前言21.1 辣椒主要治病及其防控21.2 内生菌种类及内生细菌的生防作用21.3 植物根组织内生菌的研究意义32 材料与方法42.1 培养基42.2 试剂52.3 实验仪器52.4 样本52.5 试验方法62.5.1 内生细菌的分离62.5.1.1 样本的处理62.5.1.2 内生细菌分离62.5.2 拮抗实验62.5.2.1 接菌培养62.5
2、.2.2 菌丝染色62.5.3 形态观察及革兰氏染色62.5.4 生化实验72.5.5 测序及系统进化树的构建82.5.6 解磷解钾实验82.5.7 十字交叉实验83 结果与分析93.1 内生细菌的分离及拮抗结果93.1.1 内生细菌对病原菌的拮抗效果93.1.2 内生细菌对病原菌菌丝的抑制结果103.2 形态鉴定113.2.1 菌落形态观察113.2.2 菌体形态113.3 生化鉴定结果123.4 16S rDNA鉴定结果133.5 解磷解钾及十字交叉结果144 讨论145 结论15参考文献16致谢18CONTENTSAbstract in Chinese1Abstract in Engli
3、sh.11 Introduction21.1 The main treatment of pepper and its prevention and control21.2 Endophytic bacteria and endophytic bacteria biocontrol21.3 Significance of Endophytic Bacteria in Plant Root Tissues32 Materials and methods42.1 Medium42.2 Reagent52.3 Experimental apparatus52.4 Sample52.5 Test me
4、thod62.5.1 Separation of Endophytic Bacteria62.5.1.1 Handling of samples62.5.1.2 Endogenous bacterial isolation62.5.2 Antagonistic Experiment62.5.2.1 Inoculation culture62.5.2.2 Mycelial staining62.5.3 Morphological observation and Gram stain62.5.4 Biochemical Experiments72.5.5 Equencing and Constru
5、ction of Phylogenetic Tree82.5.6 Experiment on Dissolving Phosphorus and Potassium82.5.7 Cross Experiment83 Results and Analysis93.1 Endogenous bacterial isolation and antagonism results93.1.1 Antagonistic effect of endophytic bacteria on pathogens93.1.2 Endogenous bacteria on the pathogen mycelium
6、inhibition results103.2 Form identification113.2.1 Observation of colony morphology113.2.2 Cell morphology 113.3 Biochemical identification results123.4 16S rDNA identification results133.5 Dissolved Phosphorus and Potassium Crossing Results144 Discussion 145 Conclusion15Reference16Thanks18山东农业大学学士学
7、位论文辣椒根部内生拮抗菌的分离与鉴定作者：2013级生物工程专业4班 罗雪芹指导老师：刘丽英副教授摘要：炭疽菌、根腐菌等致病真菌是引起辣椒植株患病的主要原因之一，病原菌对辣椒产生的病害使辣椒减产甚至绝收，给农业的收入带来了严重影响。而生物防治是当前的主流，因此筛选出对辣椒致病菌有较好抑制效果的生防菌具有十分重要的意义。本实验从辣椒根部分离筛选出19株内生细菌；然后进行拮抗实验，通过平板对峙筛选出3株对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、链格孢菌、炭疽菌、番茄根腐菌具有较好抑制效果的拮抗菌；再通过形态特征、生理生化指标结合16srDNA序列同源性分析，最终确定LSB-68、XXRB-
8、1为枯草芽孢杆菌，XYRB-11为漠海威芽孢杆菌。此三株菌在生物农药方面具有潜在的应用价值,并可能将在植物病害的生物防治方面发挥重要作用。关键词：生物防治；内生菌；拮抗；鉴定；芽孢杆菌Isolation and Identification of Endophytic Antagonistic Bacteria from Pepper RootAbstract: Pathogenic fungi such as anthrax and root rot fungi are one of the main causes of the disease of pepper plants. The d
9、isease caused by chrysanthemum causes the pepper to be cut or even harvested, which has a serious impact on the income of agriculture. And biological control is the current mainstream, so the screening of chili bacteria have a better inhibitory effect of biocontrol has a very important significance.
10、 In this experiment, 19 strains of endophytic bacteria were isolated from the roots of pepper. Then, three strains of Fusarium oxysporum fusarium, Fusarium spp. Fusarium, Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, The results showed that LSB-68 and XXRB-1 were Bacillus subtilis, and that of XYBB-11
11、 was determined by morphological characteristics, physiological and biochemical indexes and 16s rDNA sequence homology analysis. Bacillus subtilis. The three strains have potential application value in biological pesticides and may play an important role in biological control of plant diseases.Key w
12、ords: biological control; endophytic bacteria; antagonism; identification; Bacillus11 前言辣椒由于其独特的风味深受人们喜爱，随着农业设施的快速发展，已成为一种四季蔬菜。受其经济效益的促使，种植范围和面积不断扩大，种植密度不断增大，同时，辣椒病害的发生也呈逐年上升趋势。辣椒病害不仅使辣椒减产，严重时可造成辣椒因死棵而绝收，给辣椒生产带来严重的影响，因此正确防控好辣椒病害对提高辣椒的产量和质量有着重要意义1。1.1 辣椒主要治病及其防控炭疽菌、番茄根腐菌、链格孢菌以及多种镰刀菌是常见的植物致病真菌，通常会引起植物
13、患病，导致植株叶片枯萎，长斑，根腐，绝产等，严重影响了辣椒的产量。例如炭疽菌，它通常引起辣椒黑点炭疽病，是辣椒果实的主要病害之一，同时也能引起烂果、枯枝和叶斑等症状，严重影响辣椒品质，造成辣椒减产甚至绝收2。而辣椒根腐病有多种表现症状，但通常病部仅局限于根部和茎基部。植株发育不良，较矮小，后期病株白天萎蔫，傍晚至次日清晨尚可恢复，反复多日后植株枯死，病株茎基部及根部皮层变为褐色至深褐色，呈湿腐状，然后病部缢缩、腐烂，皮层易剥离，露出暗褐色的木质部，最后植株整个根系腐烂，萎蔫死亡1。链格孢菌则能使植株形成大量的坏死型病斑,造成叶枯,提早落叶等症状3，且其分泌的毒素能抑制植物幼苗的生长。镰刀菌不但
14、会造成辣椒等植株根、茎、叶的腐烂萎蔫，引起苗枯、穗腐、植物种子、块茎的腐烂等病害，导致作物严重的减产和损失4；而且产生多种作为此生代谢产物的真菌毒素，能杀死植物细胞核，或者富集在种子里，食用后引起人体器官的衰竭和癌变5。在农业上，辣椒病害对其生产带来了严重的影响，化学防治和生物防治是作物真菌病害的主要防治途径。而传统的农药防治方法不仅效果差、成本高，而且污染环境，相较于化学防治，生物防治作为当前的流行趋势，具有无毒无害、无污染、不产生抗药性和持续高效等优点，符合农业可持续发展的要求，是当前和未来植物病害综合防治的发展方向6。植物病害生物防治主要是利用有利微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治，其核心就是微生物，这些微生物包括细菌、真菌和放线菌等。其中一些微生物存在于植物各组织部位，具有与植物共生，不存在植物间拮抗等优点，成为目前研究的热点，这类微生物即内生菌7。1.2 内生菌种类及内生细菌的生防作用Hallmann (1997) 8 首次完整地将植物内生菌(endophyte)定义为能够在健康植物活组织内生存而不引起明显寄主植物病变的一大类微生物。内生菌的种类十分繁多，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类。其中，内生细菌(en
