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1、玻璃器皿的洗涤和包装玻璃器皿的洗涤和包装1. 玻璃器皿的洗刷：玻璃器皿的使用前必须洗刷干净。锥形瓶、试管、 培养皿等浸入水中洗涤，用毛刷和洗衣粉洗刷，然后再用水冲净。移液管 先用洗液浸泡，再用水冲洗。洗刷干净的玻璃仪器在电热干燥箱中烘干后 备用。 2. 玻璃器皿灭菌前的准备工作： （1）培养皿又称双碟或平皿，由一底一盖组成一套。可以每套单独使用 纸包装，也可将几套一起用纸包装； （2）移液管应在距管口约1-2毫米处用铁丝塞入少许棉花（约1-1.5厘米 长）；以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞的松 紧适宜。炊时以能通气但不使棉花滑下为准。塞好棉花的移液管尖端，放 在4-5厘米
2、宽的长条纸的一端，约成45角，折叠纸条包住尖端，用左手 握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌上向前搓转，以螺旋式包扎起来。 上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。3. 棉塞的制作为了过滤空气，避免污染，试管或锥形瓶口需用棉花堵塞（脱脂棉易吸 水，勿用）。为了节省棉花或节省时间，在配置实验临时所用的无菌水 和培养基时，也可以用金属试管帽代替棉塞。装液体培养基的锥形瓶口， 可包扎6-8层纱布以代替棉花。 制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指 和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞， 然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷 塞法制作
3、棉塞（见图2-2）。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙， 以防外界微生物沿缝隙浸入。棉塞 不宜过紧或过松，塞好后以手提棉 塞，以瓶、管不下落为准。图2-2 棉塞的制作过程实验 培养基的制备与灭菌棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。如制作 时不慎沾上培养基，则不可再用。在棉塞和平口外要包 以厚纸，或将塞好后的试管集中放在铁丝筐内，上面盖 以厚纸，用线绳扎好，准备灭菌，避免灭菌后冷水淋湿 棉塞，并防止接种前培养基水分散失。 上面配制好的各种培养基，分装于锥形瓶内和试管中， 分别加以捆扎，做好标记。然后灭菌备用。一、实验目的1. 了解培养基的配制原理，掌握常用培养基 的制备方法； 2. 学会
4、玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。二、基本原理 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累 代谢产物的营养基质。任何培养基中均需含有微生 物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生 长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营 养元素的要求又有很大差异。不同微生物对PH值要 求不一样，应将培养基调到一定的PH值范围。根据研究目的的不同，可将培养基制成固 体、半固体和液体三种形式。 固体培养基是在液体培养基中加入1.52.0%的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加 入0.5-0.8%的琼脂。有时为了特殊的目的， 也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培 养基。在分离、
5、培养异养微生物时，对一般细菌 常选用牛肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏 合成I号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或 豆芽汁葡萄糖培养基。三、实验器材1. 药品：牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；琼脂； 2. 仪器及其他：试管；移液管；锥形瓶；烧杯； 量筒；玻璃棒；漏斗；纱布；棉花；报纸；天平或 台秤；等。四、实验内容 （一）常用培养基的配制1. 肉膏蛋白胨培养基（用于分离及培养细菌）成分： 牛肉膏 0.5g； 蛋白胨 1.0g； 氯化钠 0.5g； 琼脂 1.52.0g； 水 100mL； PH 7.07.21、配制培养基的基本过程如下： （1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于烧杯中； （
6、2）溶解：在上述烧杯中加入所需水量（根据实验需要可加 入蒸馏水或自来水）搅匀，加热溶解。应在药品全部溶解后 加水补足加热过程所蒸发的水分。配制固体培养基时，应将 已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热 至琼脂完全融化，并不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补 足失去的水分； （3）调PH值：用1N NaOH或1N HCl调PH至7.2，尽量避免回 调； （4）分装、包扎灭菌注意： （1）牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中， 牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮， 故称量时要迅速（2）配制固体培养基时，应将已配好
7、的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全融化，并不断 搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分；或者将 琼脂单独溶解再加入到已配好的培养基中（3）调pH 检测培养基的pH，边加边搅拌，并随 时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。pH的 调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过 头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度2. 斜面培养基制作法 将已灭菌的装有琼脂培养基的试管，趁热置使成适当斜度， 凝固后即成斜面（图2-3）。制得的斜面以稍有凝结水析 出者为佳。如果制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后 则应垂直放置至冷凝。 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出12管
8、（瓶），放在30-37恒温箱中保温1-3天，不长菌者 即证明灭菌已彻底，再放阴暗处保存。图2-3 摆斜面3、倒平板（1）超净台紫外灭菌，溶化培养基 （2）酒精清洁手 （3）标记 （4）打开三角瓶 （5）左手拇指和食指打开培养皿上盖，右手托三角 瓶瓶底，倒入约15mL左右（少于1/2）培养基，水 平放置，使培养基平铺 （6）待培养基凝固后，收起，常温培养检测无菌操 作结果五、实验报告1. 分析你所配制培养基中的碳源、氮源、 能源、无机盐及维生素的来源。 2.如何检查灭过菌的培养基是无菌的？培养基的配制和灭菌发布日期：2008-07-17 来源：生技网信息中心 浏览次数：808以1000 ml “
9、MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）琼脂 + 3%（即30 g/l）蔗糖”为例。第一步：准备好配制培养基的一切用具和试以1000 ml “MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）琼脂 + 3%（即30 g/l）蔗糖”为例。第一步：准备好配制培养基的一切用具和试剂。第二步：称量5 g琼脂和30 g蔗糖，溶解在大约所要配制培养基 2/33/4左右体积（约600750 ml）的（蒸馏）水中，加热溶解，不时搅拌，避免出现琼脂生块和泡沫。第三步：根据用量，用量简或移液管从母液中取出所需量的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素（每做1000 ml培养
10、基，取20 ml大量成分、20 ml氯化钙母液、10 ml微量成分、10 ml铁盐母液和10 ml有机成分，以及3.0 mg NAA），放入预先有少量蒸馏水的烧杯中（以免加药液时溅出），然后加入琼脂和糖水溶液中搅拌混匀。第四步：加水定容。待搅拌均匀后，用数滴稀碱（NaOH）将pH值调节到预定水平（一般为pH 5.8），当pH值偏碱时用稀酸（HCl）调节。用pH试纸或酸碱指示（或pH）计测定培养基的pH值。第五步：将培养基用漏斗分装到培养容器中。每瓶加1520 ml左右，之后加盖。第六步：培养基进行灭菌。高压蒸气灭菌锅的温度为121，灭菌1520分钟。培养基常用高温高压（1.06 kg/cm2或
11、0.1 MPa，121）蒸气灭菌的方法，灭菌时间应根据培养瓶体积大小及其内培养基容量多少而定（见表4）。体积和容量越大，所需灭菌时间就越长。空试管、空三角瓶和滤纸要在130下灭30分钟或121灭60分钟。空的培养容器不应同盛装培养基的培养容器一起高压蒸气灭菌，不同体积培养容器或盛装不同容量的培养基也不能一起高压蒸气灭菌，而应该分别进行。因为热穿透力是一个需要考虑的因素，体积大的培养容器需要较长的时间灭菌，是因为热量穿透大体积培养基要比体积小的花更多的时间。利用高压蒸气灭菌锅进行灭菌具有简单、快速，并且可以附带杀灭病毒又不吸收的优点（与过滤灭茵比较）。其缺点是会引起pH值的变化、发生化学变化和引
12、起某些化合物的分解，使得某些培养基成分的活性丧失。高压蒸气灭菌会引起以下物质分解：蔗糖（分解为葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%会丧失反应活性）维生素B1、B12、C和泛酸、抗生素、酶、植物提取液（活性丧失）。所以，原生质体培养用培养基应采用过滤法灭菌。表4 培养基或无菌水的最少灭菌时间容器分装体积（mL） 121下最少灭菌时间（min）2060 1575150 20250500 251000以上 30以上过滤灭菌可以除去溶液或液体培养基中直径大于过滤膜网孔直径的微粒、微生物和病毒。与高压蒸气灭菌法相比，该法不会改变那些在高压蒸气灭菌中不稳定物质，但是也有些明显的缺点，如
13、复杂而费时。通常采用0.220.45m孔径的醋酸纤维素或硝酸纤维素膜筛。对培养基中的不稳定成分进行过滤灭菌时，首先对除不稳定成分以外的培养基进行高温高压灭菌，灭菌后放置于超净工作台中冷却，温度降到 4050时，在琼脂培养基尚未固化之前，在无菌条件下用注射器和无菌微孔滤膜（图1.7）将高温不稳定物质溶液打入培养基。一一一一、 、培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术 培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的用于培养微生物的营养基质。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。就培养基中营养物质的来源可分为天然培养基、合
14、成培养基和半合成培养基。按培养基特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。按培养基制成后的物理状态可分为固体培养基，液体培养基和半固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %-2.0 %琼脂作凝固剂; 半固体培养基则加入0.5 %-0.8 %的琼脂。 一般培养基除含有大量水分外, 还含有碳素、氮素、无机盐类和维生素等。此外, 由于徽生物生长繁殖必须在最适的酸碱度范围内, 才能表现出最大的生命活力, 因此应根据不同种类的徽生物. 将培养基调节到一定的pH值范围。 培养基配制后还必须进行灭菌, 灭菌是指杀死或消灭所有微生物, 包括营养体、孢子和芽孢。灭菌的方法很多，可分为物理方法与化
15、学方法两大类。物理方法包括湿热灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等; 化学方法主要是利用化学药品对接种室空间、用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。消毒一般是指消灭有害微生物的营养体和病原菌。 (一一一一) ) ) ) 培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法 一般培养基的配制方法如下 (各种天然培养基的配制方法略有不同)： l. 按照配方的组分及用量先分别称量并配成液体； 2. 根据要求调到一定的酸碱度(pH值)； 3. 若要制成固体则加入2%琼脂并加热融化； 4. 根据需要的数量分装入试管或三角瓶中, 加上棉塞或盖上纱布； 5. 包扎好灭菌后备用。 配制斜面培养基的一般操作步骤为：称量 溶解 调pH值 加琼脂 过滤 分装 加棉塞 包扎 灭菌 摆斜面 无菌检查。 (图9-7) (二二二二) ) ) ) 培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌 培养微生物常用的玻璃器具主要有试管、三角瓶、培养皿、吸管等, 在使用前必须先进行灭菌, 使容器中不含任何杂菌；培养微生物用的营养基质(培养基), 在接入纯种前也必须先行灭菌, 使培养基呈无菌状态。培养基可分装入器皿中一起灭菌, 也可在单独灭菌后以无菌操作分装入无菌的器皿中。 1. 棉塞制作与器皿包扎为了避免玻璃器
