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1、急性局灶性脑挫裂伤对大鼠脑微循环及神经组织超微结构的影响【摘要】 目的: 探讨大鼠脑损伤后脑微循环障碍、脑缺血及神经组织超微结构的变化规律，为临床改善脑损伤后脑微循环障碍、治疗脑缺血、促进神经功能恢复提供理论依据。方法:采用Feeneys自由落体撞击法建立急性局灶性脑挫裂伤模型，共81只大鼠，随机均分为9组，每组6只行内源性过氧化物酶组织化学染色、脑含水量测定，并进行图象分析。每组3只电镜观察微血管内皮细胞和神经组织超微结构改变。结果:脑损伤后30min伤区可见出血灶，伤区内无血管染色，伤区周围存在“微无血管区”。“微无血管区”的存在持续至伤后72h。脑损伤后30min 微血管面密度明显下降，
2、伤后48h达到高峰，直到伤后168h才有所恢复，但仍未达到正常水平。脑损伤后30 min微血管平均光密度明显下降，伤后24h、48h回升，72h再次下降，至168h仍未恢复正常。脑损伤后30 min，微血管内皮细胞有轻度受损迹象，伤后2h毛细血管腔内有微绒毛形成，伤后6h微绒毛增多。伤后1272h毛细血管腔明显狭窄。脑损伤后30min，神经细胞超微结构改变不明显，随时间的延长，神经细胞超微结构逐渐恶化，至伤后168h细胞结构完全丧失。结论：EGPO组织化学染色方法能准确反应脑损伤后脑微循环的改变；脑损伤后即发生脑缺血改变，神经细胞、毛细血管内皮细胞的损害继发于脑损伤后的缺血性改变，而脑缺血的发
3、生源于脑损伤后脑微血管结构的破坏和微循环灌注的不足。【关键词】 脑损伤；微循环；内源性过氧化物酶 【ABSTRACT】 Objective:To explore the alteration law of cerebral microcirculation,the cerebral ischemia and the ultrastructure of nervous tissue after brain injury,to furnish evidence for improving the disturbance of cerebral microcirculation after brai
4、n injury and treat the cerebral :Acute regional brain trauma was obtained by Feeneyscases in each group were performed endogenous peroxidase (EGPO) histochemical staining,water content of the brain and the charts were analyzed by CMIASof them were observed on the alteration of the microangium endoth
5、eliocyte ultrastructure and nervous :The hemorrhage was observed at the traumatic area and the blood vessel was not stained around the traumatic area, “non” or “less” microvessels area was showed and it continueddensity of microvasculature volume fraction declined atreached peak at 48h and resumed a
6、tMOD declined at 30min,raised again at 48h and 72h,declined again atmicroangium endotheliocyte was damaged at 30min,the microvilli was formed at 2h and 6h,and the cavum of micrangium was narrowed at 12 ultrastructure of nervous tissue gradually worsened after brain :EGPO histochemical staining could
7、 reflect correctly the changes of cerebralbrain ischemia appeared early after brain injury,which subsequently interferes with microvascular structure and hypoperfusion ofdamage of nervous cell and microangium endotheliocyte result in the brain ischemia,which subsequently interfere microvascular stru
8、cture and hypoperfusion of microcirculation. 【KEY WORDS】 Brain injury;Microcirculation;EGPO 2007年12月王长卿等：急性局灶性脑挫裂伤对大鼠脑微循环及神经组织超微结构的影响第6期2007年12月河北北方学院学报第6期 脑外伤后引起脑微循环障碍，继而导致损伤后脑缺血改变，已得到了越来越多的研究证实。我们通过Feeneys1自由落体撞击法建立大鼠局灶性脑挫裂伤动物模型，应用内源性过氧化物酶(Endogenous peroxidase EGPO)组织化学染色方法显示脑损伤后脑微血管形态及微血液循环状态的改变
9、，系统分析脑损伤后脑微血管内皮细胞超微结构改变，以探讨急性局灶性脑挫裂伤后脑微循环障碍的变化规律，为临床改善损伤后脑微循环障碍、促进神经功能恢复提供理论依据。 1 材料与方法 动物及分组 成年、健康Wister大鼠81只，雄性，体重200250g，随机分为对照组和脑损伤组，后者按损伤后不同观察时相点又分为30min、2h、6h、12h、24h、48h、72h、168h组，每组9只。实验方法实验操作及取材 采用Feeneys自由落体撞击法致大鼠局灶性脑挫裂伤。脑损伤组用1%戊巴比妥钠按30mg/kg体重腹腔注射麻醉，右顶开颅，以750gcm致伤力致伤；对照组开颅同损伤组，但不致伤，24h后取材。
10、脑损伤组大鼠致伤后，按预定时相点断头处死。每组6只以损伤灶为中心冠状切开脑标本，额侧一半投入10%缓冲甲醛中固定行EGPO组织化学染色；枕侧一半行脑含水量测定。每组3只脑标本在%戊二醛中固定，电镜观察微血管内皮细胞及神经细胞超微结构改变。对照组大鼠假手术后24h处死，观察指标同损伤组。脑微循环改变观察 标本在10%缓冲甲醛中固定24h后，用半导体切片机切成60m的冰冻切片，收集于玻璃皿中，用 TBS液漂洗2次，每次5min。用DABNiCl过氧化物酶孵育液染色血管10min，自来水终止染色。用涂有铬矾明胶的洁净载玻片贴片，常规脱水、透明、封片。光学显微镜观察、摄片。应用CMIAS多功能图象分析
11、系统检测微血管面密度和单位面积平均光密度。电镜观察微血管内皮细胞超微结构。微血管内皮细胞及神经细胞超微结构观察 动物处死后在损伤灶边缘取1mm3大小脑组织块，投入预冷的%戊二醛中固定。常规丙酮梯度脱水，Epon812包埋、半薄切片、定位、修块。LKB4型超薄切片机切片，厚度4050nm。室温下进行铅铀染色。JEM100CX型透射电镜观察、摄片。脑组织含水量的测定 采用干湿法计算脑组织含水量。统计学处理 数据用均数标准差表示。采用软件进行F检验，Scheffe法进行两两比较。2 结果正常及损伤后脑微循环系统 应用EGPO组织化学染色，对照组大鼠脑微血管呈棕黑色，血管走行自然，无扩张，破裂及迂曲现
12、象；血管管壁平滑，管径清晰，大小变化自然，管腔内染色深。脑损伤组伤后30min，伤区及其下方可见大面积出血灶，伤区内无血管染色；伤区周围微血管密度明显降低，且有较大面积的微无血管区。伤后2h，伤区周围微血管稀疏，染色浅淡，走行稍紊乱，存在微无血管区。伤后6h，伤区仍见大面积出血灶，伤区及出血灶内无血管染色，接近伤区的微血管断裂。伤后12h，染色微血管密度低、颜色淡，有迂曲、断裂现象，同一根血管的不同节段同时存在收缩和扩张改变。伤后24h，染色的微血管密度较低，颜色深浅不均，血管腔内同时存在深染和浅染的不同节段。伤后48h，伤区边缘大面积出血灶消失，伤区周围微血管稀疏。伤后72h，伤区边缘参差不
13、齐，伤区下方微无血管区仍存在。伤后168h，伤区边缘有微血管形成，染色的微血管密度增加，走行较自然，颜色较深，但未恢复至正常状态。图象分析显示，伤后30min微血管面密度明显下降，伤后48h达到高峰。伤后30min微血管MOD明显下降，24h、48h回升、72h再次下降，至168h仍低于正常水平。内皮细胞超微结构改变 电镜观察对照组脑微血管内皮细胞的细胞核、线粒体、高尔基复合体、粗面内质网、滑面内质网及核糖体均清晰可见；毛细血管腔内膜光滑、连续、完整，层次清楚。脑损伤组伤后30min，毛细血管内皮细胞已有受损迹象，表现为线粒体轻度肿胀，内皮细胞内吞饮小泡增加，转运增强。伤后2h，内皮细胞线粒体
14、肿胀成球状，毛细血管内膜不完整，有微绒毛形成。伤后6h，毛细血管腔内有大量微绒毛形成。伤后12h，毛细血管管腔明显狭窄，内膜因内皮细胞水肿而成弧形或曲线状，基底膜变薄，部分结构紊乱。伤后24h，微血管内细胞肿胀明显，细胞核轻度固缩，胞质内线粒体、粗面内质网肿胀呈空泡状；毛细血管腔狭窄，血管内膜凸凹不平，有断裂。伤后48h，内皮细胞核仁缩小，呈长条状；毛细血管腔呈缝状。伤后72h，内皮细胞核呈均质状，毛细血管内膜屈曲不平、有断裂；毛细血管腔呈缝状，血管周围水肿严重。伤后168h，毛细血管腔狭小，内膜不光滑、形状不规则；基底膜基本形成，但结构尚未完全恢复正常。表1 脑损伤后脑微血管面密度和MOD的
15、改变注：与对照组相比*神经细胞超微结构改变 脑损伤后30min，神经细胞核仁偏离中心，染色质边集；细胞器轻度肿胀，但轮廓尚正常。伤后2h，细胞核核膜增宽，有凸起，核仁边集，染色质散在；大部分线粒体肿胀、嵴变短；细胞内散在水肿，细胞周围明显水肿。伤后6h，线粒体肿胀呈气球状，线粒体嵴减少或消失，且存在的线粒体嵴排列紊乱。伤后12h，细胞核周围有小囊泡形成，核仁浓缩，电子密度不均匀，染色质减少；胞质内线粒体呈空泡状，粗面内质网肿胀呈椭圆形，核糖体、溶酶体减少。伤后24h，细胞核形态不规则，核周有水肿带。伤后48h，核仁固缩，染色质流入基质内。伤后72h，核仁消失，胞质内可见多处散在高电子密度物质。
16、伤后168h，整个细胞结构完全丧失。伤区脑组织含水量的变化 伤后2h脑组织含水量比对照组明显增加，至48h达到最高峰。此后逐渐减退，至伤后168h与对照组比较无明显差异。 3 讨论 创伤性脑水肿是颅脑损伤后主要的继发性病理改变，而颅脑损伤后脑微循环障碍、脑缺血是引起脑水肿的主要环节2，3。许多研究表明，重型颅脑损伤后有“超早期”脑缺血的发生4，5。以往研究脑损伤后脑微循环改变多采用灌注显色剂或铸型剂的方法以使微血管显色或铸型。由于灌注剂和灌注压的原因，灌注法不仅可能刺激血管，也可能造成微血管扩张使原本已经闭塞的微血管充填显色剂或铸型剂，甚至使微血管破裂，从而不能完全真实地反应血管形态的改变；同时，显色剂或铸型剂只能显示血管的形态而不能显示活体时的血液循环状态。EGPO广泛存在于红细胞、白细胞和血浆中，该酶性质稳定不易被固定剂破坏、不易变性。应用EGPO组织化学染色方法显示脑组织微血管的基本原理为
