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1、荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量一、实验目的:1.学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理；2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。二、实验原理:1.维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。维生素B2溶液在430440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=67的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。葡萄糖中含有维生素B1、B2
2、、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。2.荧光分光光度计 (1)常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关
3、系： 当实验条件一定时，荧光强度IF与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。(2)荧光分析法的特点:a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。(3)荧光分析仪器a.常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：光源单色器吸收池单色器检测器 b.荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：(a)荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；(b)荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰
4、。c.荧光分光光度计工作原理：由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱，简称荧光光谱。当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各
5、波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱。 当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。三、试剂与仪器:970CRT荧光光度计5 ml吸量管2只，50 ml容量瓶7只, 100 ml容量瓶1只；10.0g/ml维生素B2标准溶液，冰乙酸， 多维葡萄糖粉试样。四、实验步骤:（一）970CRT荧光光度计基本操作：1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：设置激发波长为440
6、nm，发射波长为540 nm，灵敏度2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。3.点击“测本底值”，测得本底值为1.41。（二）样品测定1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定 在6个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。2.未知试样的测定称取5.0778g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入100 ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，
7、摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。3.退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。五、数据处理:1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线：浓度(g/ml)荧光强度(I)123平均值RSD0.13.8723.8713.8663.8700.0837%0.26.6106.6016.5826.5980.1023%0.39.2239.2379.2039.2210.2112%0.411.45411.37111.46111.4290.2301%0.514.55114.55314.59514.5660.1963%0.616.87316.93016.96516.9230.2014%
8、2.未知样品浓度的测定 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。编号123平均值RSDI48.13648.13348.135 48.1350.0033%C/ug.ml-11.7951.7941.794 1.7940.0394%维生素B2百分含量=1.794*100.00/(5.0778*106)*100%=0.0035%六、注意事项:1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作；2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住侧棱。七、思考题:1.试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因?答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法，无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法较吸收光度法灵敏度高。2.维生素B2在pH67时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必须在避光条件下进行。
