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1、镜像选择（MOS）：消除抑制性消减杂交文库中假阳性克隆的方法摘要： 抑制性消减杂交（SSH）是分离差异表达转录本最有力，最普遍的方法之一。然而，SSH方法构建的文库经常含有一些代表非差异表达转录本的背景克隆。为克服这一困难，我们研究了一个简单步骤，能充分降低背景克隆的数目。这一方法的是以存在于目标与背景cDNA间的以下差异为基础的：各种背景克隆分子只单向对应于SSH中两种不同侧翼接头序列中的一种，而真正差异表达的cDNA片断同时具有两种侧翼接头序列。本文描述的方法能够筛选因这类镜像分子杂交而数目增多的分子。引言：研究许多生物学过程遗传特性最有力的方法是鉴定在这些过程中表达水平有所变化的基因。抑
2、制性消减杂交（SSH）（1，2）是差异表达基因鉴定中应用广泛，效率较高的一种基于PCR的方法（35）。它的一个关键特征是在消减的同时标准化，后者可使消减群体中目标cDNA的丰度均等。由此，能富集稀有的差异表达转录本达1000倍。但SSH实验的成功应用受限于包括cDNA样本高度复杂和cDNA样本间差异（目标）基因数目少等因素。SSH主要的缺点是在消减文库中存在一些代表非差异表达（冗余）cDNA的背景克隆。某些较难的例子（如脊椎动物大脑样本）中，消减文库中背景克隆的数目可能超过目标克隆的数目。尤其富有挑战性的问题是初步筛选过程中出现包括所谓的“假阳性” 克隆在内的差异信号，但无法通过进一步仔细分析
3、来确定。为克服这一问题，我们研发了一个简单步骤，能充分降低SSH方法构建文库中背景克隆的数目。材料与方法手术摘取E15.5和E13.5小鼠胚胎的端脑。去除脑脊膜后，从剩余的脑组织（基本神经中枢、海马和嗅核）中分离皮质。按文献（6）方法纯化总皮质RNA。人骨胳肌polyA+RNA购自Clontech(CA),174 DNA购自Promega(WI)。用模板转换技术（SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit;Clontech）合成双链cDNA。然后用PCR-SlecteTM cDNA Subtraction Kit（Clontech；详细方案见7，8）消减PCR扩增的cDNA。
4、我们在SSH方案中引进了若干能提高这一方法效率的修改。一般要想得到成功的SSH结果,初步PCR不能多于27个循环。这与有约1000或更多的cDNA分子被扩增相应（9，10）。对于我们的大脑cDNA消减，为了扩增消减样本到1020ng/l的浓度，初步PCR需要30个循环。为克隆这一问题，我们进行了10管独立的初步PCR，合并样本并稀释1000倍。而后用与初步PCR同样的引物和条件进行1012个循环的PCR再次扩增到样本浓度达1020ng/l。这一额外的PCR步骤大降低了那些可能在第二步PCR中（或后）被扩增的背景分子的比例。这类背景cDNA来自于检测子与检测子的同源杂交，其末端和起始端只与两个巢
5、式PCR引物中的一个相连接（NP1或NP2，见下文）。这类两侧端对称的分子的扩增，因抑制性PCR效应，在初步PCR中被抑制，但能在第二步PCR中扩增。这一类型的背景对于镜像选（MOS）是相当危险的，因MOS过程是基于对两侧对称连接NP2R引物的cDNA分子的选择。第二步（巢式）PCR用以下引物进行：NP1，5-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT(划线处为XmaI限制性内切位点)；NP2R，5-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT。PCR产物酚氯仿抽提，乙醇沉淀。沉淀用适量NTE缓冲液（10mM NaCl, 10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA）溶解，要求cDNA浓度为
6、2030ng/l。5l cDNA样本与2l 10XmaI 内切酶缓冲液，12l水和1l XmaI（10U/l）混合，37反应1小时，以去除NP1接头。然后，加2l 200mM EDTA，70加热10分钟，灭活酶。1微升XmaI消化cDNA（57ng）与1l 4杂交缓冲液（2 M NaCl,200mM HEPES pH 8.3,0.8 mM EDTA），2l 水在某些模式实验中或是加2l驱赶子人骨胳肌cDNA (300 ng/l)在热循环仪中98加热1.5分钟，然后68加热312小时。须注意，在理论上杂交持续时间对MOS的结果有很大的影响。杂交时间太短会导致高丰度cDNA富集较多，而稀有cDNA
7、 因重退火的二级动力学而丢失。典型SSH样本，其复杂程度应不超过103种独立的cDNA。这类低复杂度的样本在相对较短的时间内就能几乎完全重退火。我们的实践表明3小时的杂交时间是足够的,继续延长杂交对MOS的效率几乎没有什么影响。杂交后，样本与200l的稀释缓冲液（50 mM NaCl,20 mM HEPES pH 8.3,0.2 mM EDTA）混合并在热循环仪中70加热7分钟。1微升稀释的cDNA用于随后的PCR（PCR总体积为20l）。PCR混合物含有1Advantage KlenTaq 聚合酶混合物及所供的缓冲液（Clontech），200M dNTP和0.6M接头特异性引物NP2R（5
8、-GGTCGCGGCCGAGGT；设计这一比NP2R短的引物以降低出现于短DNA片断的强抑制性PCR效应）。PCR混合物在热循环仪中72加热2分钟，以延伸DNA双链的3端，并立即进行程序（25个循环；Hybaid OmniGene 热循环仪，管控制模式）95，7秒；62，20秒；72，2分钟。一般，每个特定样本所需的PCR循环数应用实验测定（通常是1823个循环）。注意，在XmaI消化后，样本中仍保留有一小部分完整的NP1接头。杂交之后，具双向接头的DNA链退火形成的目标双链带有源于NP1接头的未成对3-端碱基。由于Advantage KlenTaq聚合酶混合物中含有校正聚合酶，这些碱基不会阻
9、断3-端的延伸。PCR产物用PCRScript Cloning Kit（Stratagene，CA）克隆到pCR-Script Amp中。用150l 含氨苄青霉素的LuriaBertrani 培养液排列随机选取的克隆于96孔的微量滴定平皿，摇床上培养过夜。用NP2R引物在96孔PCR平皿中PCR一微升的细菌培养物。PCR产物点样于尼龙膜。按文献(11)所述,用32dATP标记的顺、反消减cDNA分别与膜杂交。结果与讨论SSH是基于抑制性PCR效应的技术，抑制性PCR效应由附着于DNA片断末端的长反向末端重复序列介导（12）。通过在PCR扩增方案中整合抑制效应，SSH方法标准化了扩增cDNA群体
10、中的序列丰度，并防止了非目标DNA片断的扩增。这一SSH方案包括以下主要步骤：(i)分检测子cDNA为两个样本，并用两种不同的抑制性接头分别连接两个样本；(ii)检测子与过量的驱赶子杂交；和(iii)两侧接有不同抑制性接头的检测子cDNA分子（这些片断包含富集和标准化了的目标cDNA）（1，2，7，8）的扩增。我们提出SSH中背景扩增主要来源于以下两个方面。(i)由未连接的抑制性接头形成的长寡聚核苷酸能在消减杂交中与有相似序列的cDNA分子非特异性退火。DNA延伸后，这类分子可作为SSH初步和第二步（巢式）PCR模板。同样，PCR引物的非特异性退火也可产生某些背景。(ii)一些冗余的cDNA分
11、子偶尔会逃避过驱赶子杂交的清除并在随后的PCR中扩增。对于任何一种冗余cDNA而言，后一解释都是极不可能的。我们估计在消减杂交后用于PCR的几千个其它的cDNA分子中，只有单个各种冗余cDNA的分子。然而，相对于目标cDNA极度过量的冗余序列可能累积导致这类背景分子数目较多。（i）型背景克隆用差异筛选就能轻松鉴定，因其不产生差异信号。相反，(ii)型背景克隆在用制备于两个相反（顺、反）消减样本的探针进行筛选的过程中有差异信号。只有Northern 斑点和RTPCR分析才能证实这类序列在起始mRNA样本中的丰度相等。因此，在消减文库分析中这类背景的清除是最为困难和费时的步骤。作为用消减的探针进行
12、筛选一个代替，用检测子和驱赶子cDNA作为差异筛选的探针是可能的，但这种情况下，许多代表稀有转录本的克隆也将没信号。我们研究了一个特殊过程可降低消减样本中背景克隆的比例。这一技术是基于PCR后，每种背景分子只单向相关于接头序列。这单一方向对应于起源分子的方向。相反，目标cDNA片断因在SSH过程中高效富集而涉及PCR扩增。结果，每一特异性序列拥有多个起源分子并体现了两个序列方向。我们称我们的方法为MOS，因为目标与背景群体的差异被利用于目标分子的特异性扩增（图1）。这一过程包括用限制性内切酶除去一个接头（图1中的接头B），SSH样本的热变性和退火。由两端都带有接头A的目标cDNA形成新的杂交体
13、。这类分子的形成是由于带有接头A与B的镜像分子的杂交。因此，它只能来源于目标cDNA片断。接着，补平3-端,用对应于接头A的引物进行PCR.。在PCR中仅有两端都带有接头A的分子能被指数级扩增。因此，最后的PCR产物富集了目标序列。在模式实验中我们证实了这一方案。为创建人工检测子样本，我们在人骨胳肌双链cDNA中加入了不同量噬菌体174 DNA作为目标。加入174 DNA的量是人cDNA的0.01%或0.001%。无细菌DNA的相同cDNA作为驱赶子。检测子与驱赶子都用HaeIII消化用于SSH和随后的MOS过程。图2给出了最后PCR产物的电泳分析结果。消减含0.01%目标序列的检测子消减之后
14、，对应于174 的带型清晰可见，但也存在对应于背景cDNA的较亮拖影（带1；对照174 DNA在带7）。带2中拖影不明显表明MOS程序降低了背景的水平。含0.001%目标序列的检测子的消减更证实了MOS的效率。这种情况下，SSH产物只有拖影而没有明显的带（带4），明显只含很低比例的目标DNA。而MOS后，样本含有对应于一些174 片断的亮带（带5）。在这些模式实验中，我们还检测了MOS过程中在杂交混合物中加入过量的驱赶子（如SSH方法所描述的）（带3、6）。很明显驱赶子的加入并没有富集目标序列，但增强了背景带。因此，在后面的实验中我们没有用这一步。在我们的实践中，我们成功地重复应用了MOS技术
15、，包括下面真正运用MOS的例子。神经组织的结构异质性和由之而来的基因表达的高度复杂性给分离那些哺乳动物大脑发展调控的基因带来了很大的挑战。为鉴定小鼠皮质神经元分子特征确立相关的基因，我们比较了由13和15天胚胎大脑皮质的cDNA样本（E13和E15）。这一比较和分离序列的详细描述将另行发表。下面这个实验的统计分析，例证了在某些消减产物中标克隆比例较小的情况下MOS的效率（表1）。用SSH方法进行了两个方向的消减：用E13作检测子E15作驱赶子（E13E15），及与之相反（E15E13）。克隆消减产物E15E13，并用前述两种消减cDNA探针差异筛选分析来自这一文库的192个克隆。筛选发现17个差异克隆（所有分析克隆的9），进一步分析（用起始E13和E15扩增cDNA样本进行Southern斑点杂交）证实这17个中只有四个（假定差异克隆的24）有差异表达。消减样品应用MOS技术后，E15特异文库中480个克隆的初步筛选，发现87个差异表达克隆（所分析克隆的18），当中有71个（假定差异克隆的82）在进一步分析中被证实。这个例子中，MOS增高了真正差异克隆的比例达7.5倍，降低富集样本中假阳性克隆比例达4倍。应该注意到MOS文库中确定差异克隆的复杂度是相当高的，71个克隆中有62个代表了差异cDNA。因此，SSH法的一个主要特点：同时分离多个差异表达序列，得到了保留。
